原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定
Summary
本稿では、初代患者特異的なヒト大動脈平滑筋細胞および皮膚線維芽細胞を単離および培養するための外植培養ベースの方法について説明する。さらに、細胞収縮の測定およびその後の分析のための新規な方法が提示され、これはこれらの細胞における患者特異的な差異を研究するために使用することができる。
Abstract
平滑筋細胞(SMC)は、大動脈媒体における優勢な細胞型である。それらの収縮機構は、大動脈における力の伝達に重要であり、血管収縮および血管拡張を調節する。SMC収縮装置タンパク質をコードする遺伝子の変異は、胸部大動脈瘤などの大動脈疾患と関連している。SMC収縮を インビトロ で測定することは、特にハイスループット方式で困難であり、これは患者材料をスクリーニングするために不可欠である。現在利用可能な方法は、この目的には適していません。本稿では、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)に基づく新しい方法を提示する。まず、大動脈瘤の研究のために、大動脈生検および患者特異的ヒト原発性皮膚線維芽細胞から患者特異的ヒト原発性SMCを単離するための外植プロトコルが記載されている。次に、これらの細胞の収縮応答を測定するための新しい収縮方法の詳細な説明が与えられ、その後の分析および異なるグループを比較するための提案を含む。この方法は、翻訳(心臓血管)研究および患者および薬物スクリーニング研究の文脈における接着細胞の収縮を研究するために使用することができる。
Introduction
平滑筋細胞(SMC)は、大動脈内側層、大動脈の最も厚い層における優勢な細胞型である。壁内では、それらは放射状に配向しており、他の機能の中でも特に、血管収縮および血管拡張に関与する1。このSMC収縮機構は、細胞外マトリックス2との機能的リンクを介して大動脈における力の伝達に関与している。平滑筋ミオシン重鎖(MYH11)および平滑筋アクチン(ACTA2)などのSMC収縮装置のタンパク質をコードする遺伝子の変異は、家族性胸部大動脈瘤の症例に関連しており、大動脈の構造的および機能的完全性の維持におけるSMC収縮の関連性を強調している1,2.さらに、TGFβシグナル伝達経路の変異は大動脈瘤とも関連しており、大動脈瘤の病態生理におけるそれらの効果も皮膚線維芽細胞3において研究することができる。
インビトロでのSMC収縮のハイスループット測定は困難です。SMCの収縮性はヒトのインビボでは測定できないため、ヒト細胞に対するインビトロアッセイは実現可能な代替手段を提示します。さらに、動物モデルにおける腹部大動脈瘤(AAA)の発生は、例えばエラスターゼ灌流によって化学的に誘導されるか、または特定の変異によって引き起こされる。したがって、動物データは、喫煙、年齢、および/またはアテローム性動脈硬化症などの多因子的原因を主に有するヒトにおけるAAA発症とは比較にならない。インビトロSMC収縮性は、これまで主に牽引力顕微鏡4、5、Fura−2蛍光細胞内カルシウムフラックス6の定量、およびコラーゲンしわアッセイ7によって測定されてきた。牽引力顕微鏡は、単一細胞によって生成される力に関する非常に貴重な数値的洞察を提供しますが、複雑な数学的データ処理と一度に1つの細胞の分析のためにハイスループットスクリーニングには適していません。Fura-2色素およびコラーゲンしわアッセイは、収縮の表面的な決定を可能にし、正確な数値出力を与えないため、患者固有の差異を区別するのにはり適していません。腹部大動脈瘤患者の大動脈由来の細胞におけるSMC収縮障害は、インビトロでSMC収縮を測定するための新規な方法を最適化することによって初めて実証された8。これは、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)法を再利用することによって行われました。ECISは、創傷治癒および遊走アッセイ12、13、14におけるSMC増殖および挙動などの付着性細胞挙動および収縮9、10、11の定量化のためのリアルタイム、中程度スループットアッセイである。正確な方法については、プロトコルのセクションで説明します。この最適化された方法で、ECISは、それらの類似したサイズおよび形態による線維芽細胞収縮を研究するためにも使用することができる。
この論文の目的は、ECIS8を使用してインビトロでSMC収縮を測定し、対照SMCと患者SMCとの間の収縮を比較する方法の段階的な説明を提供することである。まず、コントロールおよび患者の大動脈生検からの初代SMCの単離および培養について説明し、これは収縮測定に使用することができる。第2に、収縮の測定および分析について、SMCマーカー発現の検証とともに、説明する。さらに、本稿では、患者特異的皮膚線維芽細胞の単離方法についても、同様の手法を用いて収縮を測定することができる。これらの細胞は、大動脈瘤または他の心血管病理に焦点を当てた患者特異的研究15、または動脈瘤手術前の収縮測定を可能にする分化転換プロトコールを用いた予後研究16に使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、インピーダンスと表面占有の変化に基づいて、 SMC収縮をin vitroで測定する方法を提示する。まず、患者固有の初代ヒトSMCおよび皮膚線維芽細胞の単離、培養、および拡大について説明し、続いて収縮測定にそれらを使用する方法を説明する。
この研究の限界は、外植プロトコルを介して細胞を得ることに関連している。生検から増殖する細胞は、 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tara van Merrienboer、Albert van Wijk、Jolanda van der Velden、Jan D. Blankensteijn、Lan Tran、Peter L. Hordijk、PAREL-AAAチーム、およびアムステルダムUMC、Zaans Medisch Centrum、Dijklander病院のすべての血管外科医に、この研究のための材料と支援を提供してくれたことに感謝の意を表したいと思います。
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Riferimenti
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