Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro
Summary
Este artigo descreve um método baseado em cultura explant para o isolamento e cultivo de células musculares humanas aórticas humanas primárias e específicas do paciente e fibroblastos dérmicos. Além disso, é apresentado um novo método para medir a contração celular e a análise subsequente, que pode ser usado para estudar diferenças específicas do paciente nessas células.
Abstract
As células musculares lisas (SMCs) são o tipo de célula predominante na mídia aórtica. Sua máquina de fundição é importante para a transmissão da força na aorta e regula a vasoconstrição e vasodilatação. Mutações em genes codificados para as proteínas do aparelho contítil do SMC estão associadas a doenças aórticas, como aneurismas de aoórtico torácico. Medir a contração de SMC in vitro é desafiador, especialmente de forma de alto rendimento, o que é essencial para a triagem do material do paciente. Atualmente, os métodos disponíveis não são adequados para este fim. Este artigo apresenta um novo método baseado no sensor de impedância de células elétricas (ECIS). Primeiro, um protocolo de explant é descrito para isolar os SMCs primários humanos específicos do paciente de biópsias aórticas e fibroblastos dérmicos humanos específicos do paciente para o estudo de aneurismas àórtica. Em seguida, é dada uma descrição detalhada de um novo método de contração para medir a resposta contratil dessas células, incluindo a análise subsequente e sugestão para comparar diferentes grupos. Este método pode ser utilizado para estudar a contração de células aderentes no contexto de estudos translacionais (cardiovasculares) e estudos de triagem de pacientes e medicamentos.
Introduction
As células musculares lisas (SMCs) são o tipo de célula predominante na camada medial aórtica, a camada mais grossa da aorta. Dentro da parede, eles são radialmente orientados e estão envolvidos, entre outras funções, vasoconstrição e vasodilatação1. O maquinário contratado da SMC está envolvido na transmissão de força na aorta através do vínculo funcional com a matriz extracelular2. Mutações em genes codificados para as proteínas do aparelho contítil SMC, como a cadeia pesada de miosina muscular lisa (MYH11) e a actina muscular lisa (ACTA2), têm sido relacionadas a casos de aneurismas aórticos torácicos familiares, ressaltando a relevância da contração do SMC na manutenção da integridade estrutural e funcional da aorta 1,2 . Além disso, mutações na via de sinalização TGFβ também estão associadas a aneurismas de aoórtico, e seus efeitos na fisiopatologia aneurisma aórtica também podem ser estudados em fibroblastos de pele3.
A medição de alta produtividade da contração SMC in vitro é desafiadora. Como a contratude do SMC não pode ser medida in vivo em humanos, ensaios in vitro em células humanas apresentam uma alternativa viável. Além disso, o desenvolvimento do aneurisma de aoórtico abdominal (AAA) em modelos animais é quimicamente induzido por, por exemplo, perfusão elastase, ou causada por uma mutação específica. Portanto, os dados animais não são comparáveis ao desenvolvimento de AAA em humanos, que tem principalmente uma causa multifatorial, como tabagismo, idade e/ou aterosclerose. In vitro A contratilidade da SMC tem sido medida principalmente pela microscopia de forçade tração 4,5, quantificação dos fluxos de cálcio intracelular6 da Fluorescência Fura-2 e pelos ensaios de enrugamento de colágeno7. Embora a microscopia de força de tração forneça uma visão numérica inestimável das forças geradas por uma única célula, ela não é adequada para a triagem de alto rendimento devido ao complexo processamento de dados matemáticos e à análise de uma célula de cada vez, o que significa que é muito demorado medir um número representativo de células por doador. Os ensaios de enrugação de corante e colágeno fura-2 permitem a determinação superficial da contração e não dão uma saída numérica precisa, tornando-os menos adequados para discriminar diferenças específicas do paciente. A contração prejudicada do SMC em células derivadas da aorta de pacientes com aneurisma de aorta abdominal foi demonstrada pela primeira vez pela otimização de um novo método para medir a contração de SMC in vitro8. Isso foi feito redefinindo o método de sensor de sensoriamento de impedância de células elétricas (ECIS). O ECIS é um ensaio de média-produção em tempo real para quantificação do comportamento celular aderente e contração 9,10,11, como o crescimento e o comportamento do SMC na cicatrização de feridas e ensaios migratórios 12,13,14. O método exato está descrito na seção de protocolo. Dessa forma otimizada, o ECIS também pode ser usado para estudar a contração do fibroblasto devido ao seu tamanho e morfologia semelhantes.
O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição passo a passo do método de medição da contração de SMC in vitro usando ECIS8 e comparando a contração entre controle e SMCs do paciente. Em primeiro lugar, explica-se o isolamento e o cultivo de SMCs primários a partir do controle e biópsias aórticas do paciente, que podem ser utilizadas para a medição da contração. Em segundo lugar, são descritas medidas de contração e análise, juntamente com a verificação da expressão do marcador SMC. Além disso, este artigo descreve o método de isolamento de fibroblastos dérmicos específicos do paciente cuja contração pode ser medida utilizando a mesma metodologia. Essas células podem ser usadas para estudos específicos do paciente focados em aneurisma de aorta ou outras patologias cardiovasculares15 ou estudos prognósticos usando um protocolo de transdiferenciação que permite a medição da contração antes da cirurgia de aneurisma16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta um método para medir a contração do SMC in vitro, com base nas mudanças de impedância e ocupação superficial. Em primeiro lugar, descreve-se o isolamento, a culminação e a expansão de SMCs humanos primários específicos do paciente e fibroblastos de pele, seguidos de como usá-los para medidas de contração.
Uma limitação do estudo está relacionada à obtenção das células através de um protocolo de explant. As células que se proliferam da bi?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer com gratidão Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, a equipe DO PAREL-AAA, e todos os cirurgiões vasculares do UmC de Amsterdã, Zaans Medisch Centrum e Dijklander por fornecerem materiais e apoio para este estudo.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
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