Denne artikel beskriver en veletableret og reproducerbar lectin plet assay for hele mount retinal præparater og de protokoller, der kræves for den kvantitative måling af vaskulære parametre ofte ændret i proliferative og ikke-proliferative retinopatier.
Retinopatier er en heterogen gruppe af sygdomme, der påvirker det neurosensoriske væv i øjet. De er karakteriseret ved neurodegeneration, glioose og en progressiv ændring i vaskulær funktion og struktur. Selvom retinopatiernes begyndelse er karakteriseret ved subtile forstyrrelser i visuel opfattelse, er ændringerne i vaskulær plexus de første tegn, der opdages af klinikere. Fraværet eller tilstedeværelsen af neovascularization bestemmer, om retinopatien er klassificeret som enten ikke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I denne forstand forsøgte flere dyremodeller at efterligne specifikke vaskulære træk ved hvert trin for at bestemme de underliggende mekanismer, der er involveret i endotelændringer, neuronal død og andre begivenheder, der finder sted i nethinden. I denne artikel vil vi give en komplet beskrivelse af de procedurer, der kræves til måling af retinale vaskulære parametre hos voksne og tidlige fødselsmus på postnatal dag (P)17. Vi vil detaljer protokollerne til at udføre retinal vaskulær farvning med Isolectin GSA-IB4 i hele mounts til senere mikroskopisk visualisering. Vigtige trin til billedbehandling med Image J Fiji-software leveres også, derfor vil læserne være i stand til at måle fartøjstæthed, diameter og tortuositet, vaskulær forgrening samt avaskulære og neovaskulære områder. Disse værktøjer er meget nyttige til at evaluere og kvantificere vaskulære ændringer i både ikke-proliferative og proliferative retinopatier.
Øjnene næres af to arterio-venøse system: choroidal vaskulatur, et eksternt vaskulært netværk, der vander retinal pigmenteret epitel og fotoreceptorer; og neuro-retinal vaskulatur, der vander ganglion celler lag og det indre nukleare lag af nethinden1. Den retinale vaskulatur er et organiseret netværk af fartøjer, der leverer næringsstoffer og ilt til retinale celler og høste affaldsprodukter for at sikre korrekt visuel signalering transduktion. Denne vaskulatur har nogle forskellige funktioner, herunder: manglen på autonome innervation, regulering af vaskulær tone ved iboende retinale mekanismer og besiddelse af en kompleks retinal-blod barriere2. Derfor har retinal vaskulatur været i fokus for mange forskere, der i vid udstrækning har studeret ikke kun vasculogenese under udviklingen, men også de ændringer og den patologiske angiogenese, som disse fartøjer gennemgår i sygdomme3. De mest almindelige vaskulære ændringer observeret i retinopatier er fartøjsudvidelse, neovascularization, tab af vaskulær arborisering og deformation af de retinale hovedbeholdere, hvilket gør dem mere ziggaggy4,5,6. En eller flere af de beskrevne ændringer er de tidligste tegn, der skal opdages af klinikere. Vaskulær visualisering giver en hurtig, ikke-invasiv og billig screeningsmetode7. Den omfattende undersøgelse af de ændringer, der observeres i det vaskulære træ, vil afgøre, om retinopatien er ikke-proliferativ eller proliferativ og den videre behandling. De ikke-proliferative retinopatier kan manifestere sig med afvigende vaskulær morfologi, nedsat vaskulær tæthed, acellulære kapillærer, pericytter død, makulaødem, blandt andre. Hertil kommer, proliferative retinopatier også udvikle øget vaskulær permeabilitet, ekstracellulære remodeling, og dannelsen af vaskulære totter mod glaslegeme hulrum, der let nedbryde eller fremkalde nethinde løsrivelse8.
Når det er opdaget, retinopati kan overvåges gennem sine vaskulære ændringer9,10. Patologiens progression kan følges gennem de strukturelle ændringer af fartøjerne, som klart definerer stadier af sygdommen11. Kvantificeringen af vaskulære ændringer i disse modeller gjorde det muligt at korrelere fartøjsændringer og neuronal død og teste farmakologiske behandlinger for patienter i forskellige faser af sygdommen.
I lyset af ovenstående udsagn mener vi, at anerkendelse og kvantificering af vaskulære ændringer er grundlæggende i retinopatier undersøgelser. I dette arbejde vil vi vise, hvordan man måler forskellige vaskulære parametre. For at gøre det vil vi anvende to dyremodeller. En af dem er oxygen-induceret retinopati mus model12, som efterligner Retinopati af Præmaturitet og nogle aspekter af proliferative diabetisk Retinopati13,14. I denne model vil vi måle avaskulære områder, neovaskulære områder og udvidelse og tortuositet af hovedfartøjer. I vores laboratorium er der udviklet en metabolisk syndrom (MetS) musemodel, som fremkalder en ikke-proliferativ retinopati15. Her vil vi evaluere vaskulær tæthed og forgrening.
Dyremodeller af retinopatier er kraftfulde værktøjer til at studere vaskulær udvikling, ombygning eller patologisk angiogenese. Succesen af disse undersøgelser på området afhænger af den nemme adgang til vævet, der gør det muligt at udføre en bred vifte af teknikker, der giver data fra in vivo og postmortem mice26,27. Desuden er der fundet stor korrelation mellem in vivo-undersøgelser og klinisk analyse, hvilket giver solid s…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Carlos Mas, María Pilar Crespo og Cecilia Sampedro fra CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjælp til konfokal mikroskopi, til Soledad Miró og Victoria Blanco for dedikeret dyrepleje og Laura Gatica for histologisk bistand. Vi takker også Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) for videoproduktion og udgave og Paul Hobson for hans kritiske læsning og sprog revision af manuskriptet.
Denne artikel er finansieret af tilskud fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alt til M.C.S.).
Aluminuim foil | |||
Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
200 µL tube | Merck | Z316121 | |
Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
Potassium chloride | Merck | P9541 | |
Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sodium chloride | Merck | S3014 | |
Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |