Kvantifisering av vaskulære parametere i hele fjellet netthinner av mus med ikke-proliferative og proliferative retinopatier

Summary

Denne artikkelen beskriver en veletablert og reproduserbar lectin flekkanalyse for hele fjellet retinal preparater og protokollene som kreves for kvantitativ måling av vaskulære parametere ofte endret i proliferative og ikke-proliferative retinopatier.

Abstract

Retinopatier er en heterogen gruppe sykdommer som påvirker øyets nevrosensoriske vev. De er preget av nevrodegenerasjon, gliose og en progressiv endring i vaskulær funksjon og struktur. Selv om utbruddet av retinopatiene er preget av subtile forstyrrelser i visuell oppfatning, er modifikasjonene i vaskulær plexus de første tegnene som oppdages av klinikere. Fraværet eller tilstedeværelsen av neovascularization bestemmer om retinopatien er klassifisert som enten ikke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I denne forstand prøvde flere dyremodeller å etterligne spesifikke vaskulære egenskaper i hvert trinn for å bestemme de underliggende mekanismene som er involvert i endotelendringer, nevronal død og andre hendelser som finner sted i netthinnen. I denne artikkelen vil vi gi en fullstendig beskrivelse av prosedyrene som kreves for måling av retinal vaskulære parametere hos voksne og tidlige fødselsmus på barseldag (P)17. Vi vil detaljere protokollene for å utføre retinal vaskulær farging med Isolectin GSA-IB4 i hele mounts for senere mikroskopisk visualisering. Viktige trinn for bildebehandling med Image J Fiji-programvare er også gitt, derfor vil leserne kunne måle kartetthet, diameter og tortuositet, vaskulær forgrening, samt avaskulære og neovascular områder. Disse verktøyene er svært nyttige for å evaluere og kvantifisere vaskulære endringer i både ikke-proliferative og proliferative retinopatier.

Introduction

Øynene er næret av to arterio-venøse system: choroidal vaskulatur, et eksternt vaskulært nettverk som irrigerer retinal pigmentert epitel og fotoreseptorer; og nevroretinal vaskulatur som irrigerer ganglioncellelaget og det indre kjernefysiske laget av netthinnen1. Retinal vaskulaturen er et organisert nettverk av kar som leverer næringsstoffer og oksygen til netthinnecellene og høster avfallsprodukter for å sikre riktig visuell signaltransduksjon. Denne vaskulaturen har noen forskjellige egenskaper, inkludert: mangelen på autonom innervering, regulering av vaskulær tone ved iboende retinalmekanismer og besittelse av en kompleks retinal-blodbarriere2. Derfor har retinal vaskulatur vært fokus for mange forskere som i stor grad har studert ikke bare vaskulogenese under utviklingen, men også endringene og den patologiske angiogenesen som disse karene gjennomgår i ^sykdommer3. De vanligste vaskulære endringene som observeres i retinopatier er kardilatasjon, neovascularization, tap av vaskulær arborisering og deformasjon av retinal hovedkarene, noe som gjør dem mer ziggaggy4,5,6. En eller flere av de beskrevne endringene er de tidligste tegnene som skal oppdages av klinikere. Vaskulær visualisering gir en rask, ikke-invasiv og billig ^{screeningmetode7}. Den omfattende studien av endringene som observeres i det vaskulære treet, vil avgjøre om retinopatien er ikke-proliferativ eller proliferativ og den videre behandlingen. De ikke-proliferative retinopatiene kan manifestere seg med avvikende vaskulær morfologi, redusert vaskulær tetthet, acellulære kapillærer, pericytter død, makulaødem, blant andre. I tillegg utvikler proliferative retinopatier også økt vaskulær permeabilitet, ekstracellulær ombygging og dannelsen av vaskulære tufts mot glasslegemet som lett bryter ned eller induserer retinal løsrivelse8.

Når retinopatien er oppdaget, kan den overvåkes gjennom sine vaskulære ^{endringer9,10}. Progresjonen av patologien kan følges gjennom de strukturelle endringene i karene, som klart definerer stadier av ^sykdommen11. Kvantifiseringen av vaskulære endringer i disse modellene tillot å korrelere karendringer og nevronal død og å teste farmakologiske terapier for pasienter i ulike faser av sykdommen.

I lys av de ovennevnte uttalelsene anser vi at anerkjennelse og kvantifisering av vaskulære endringer er grunnleggende i retinopatistudier. I dette arbeidet vil vi vise hvordan du måler forskjellige vaskulære parametere. For å gjøre det, vil vi ansette to dyremodeller. En av dem er den oksygeninduserte retinopatimusemodellen12, som etterligner Retinopati av prematuritet og noen aspekter av proliferativ diabetisk retinopati13,14. I denne modellen vil vi måle avaskulære områder, neovascular områder og dilatasjon og tortuositet av hovedfartøy. I vårt laboratorium er det utviklet en metabolsk syndrom (MetS) musemodell, som induserer en ikke-proliferativ ^retinopati15. Her vil vi evaluere vaskulær tetthet og forgrening.

Protocol

C57BL/6J-mus ble håndtert i henhold til retningslinjene i ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. Eksperimentelle prosedyrer ble utformet og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) ved Fakultet for kjemisk vitenskap, National University of Córdoba (Res. HCD 1216/18). 1. Utarbeidelse av bufferløsninger og reagenser Tilberedning av 1x fosfatbuffer saltvann (PBS): Tilsett 8 g natriumklorid (NaCl), 0,2 g kaliumklorid…

Representative Results

Som beskrevet i protokolldelen, fra en enkelt fluorescerende fargeanalyse, kan du få den vaskulære morfologien og evaluere flere parametere av interesse kvantitativt. Søket av en bestemt endring vil avhenge av hvilken type retinopati som studeres. I denne artikkelen ble avascular og neovascular områder, tortuositet og dilatasjon evaluert i en musemodell av proliferativ retinopati, mens vaskulær forgrening og tetthet ble analysert i en MetS-musemodell, som induserer en ikke-proliferativ retinopati. <p class="jove…

Discussion

Dyremodeller av retinopatier er kraftige verktøy for å studere vaskulær utvikling, ombygging eller patologisk angiogenese. Suksessen til disse studiene i feltet er avhengig av enkel tilgang til vevet som gjør det mulig å utføre et bredt spekter av teknikker, og gir data fra in vivo og postmortem ^mus26,27. Videre er det funnet stor sammenheng mellom in vivo-studier og klinisk analyse, noe som gir solid sporbarhet og pålitelighet t…

Materials

Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis