JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2

Published: November 05, 2021
doi:
10.3791/63127
, , , , ,
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Denne protokol beskriver dynamikken i virusinfektioner ved hjælp af luciferase- og fluorescensekspressive rekombinante (r) SARS-CoV-2 og et in vivo-billeddannelsessystem (IVIS) i K18 hACE2 transgene mus for at overvinde behovet for sekundære tilgange, der kræves for at studere SARS-CoV-2-infektioner in vivo.

Abstract

Coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) pandemi er forårsaget af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Til dato har SARS-CoV-2 været ansvarlig for over 242 millioner infektioner og mere end 4,9 millioner dødsfald på verdensplan. I lighed med andre vira kræver undersøgelse af SARS-CoV-2 anvendelse af eksperimentelle metoder til påvisning af tilstedeværelsen af virus i inficerede celler og / eller i dyremodeller. For at overvinde denne begrænsning genererede vi replikationskompetente rekombinante (r) SARS-CoV-2, der udtrykker bioluminescerende (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner. Disse reporter-udtrykkende rSARS-CoV-2 tillader sporing af virusinfektioner in vitro og in vivo baseret på ekspressionen af Nluc og Venus reportergener. Her beskriver undersøgelsen brugen af rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus til at detektere og spore SARS-CoV-2-infektion i det tidligere beskrevne K18 humane angiotensin-konverterende enzym 2 (hACE2) transgene musemodel af infektion ved hjælp af in vivo imaging systems (IVIS). Denne rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus viser rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenicitet og viral replikation in vivo. Det er vigtigt, at Nluc og Venus udtryk giver os mulighed for direkte at spore virusinfektioner in vivo og ex vivo, i inficerede mus. Disse rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus repræsenterer en glimrende mulighed for at studere biologien af SARS-CoV-2 in vivo, forstå virusinfektion og tilhørende COVID-19 sygdom og identificere effektive profylaktiske og / eller terapeutiske behandlinger til bekæmpelse af SARS-CoV-2-infektion.

Introduction

Alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er en indhyllet, positiv sans, enkeltstrenget RNA-virus, der tilhører Betacoronavirus-slægten i Coronaviridae-familien 1. Denne virale familie er opdelt i Alpha-, Beta-, Gamma- og Delta-coronavirus1. Alfa- og betacoronavirus inficerer hovedsageligt pattedyr, mens Gamma- og Deltacoronavirus næsten udelukkende inficerer fugle2. Til dato har syv coronavirus (CoV) krydset artsbarrierer og opstået som humane coronavirus (HCoV): to alfa-CoV’er (HCoV-229E og HCoV-NL63) og fem beta-CoV’er (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Mellemøsten respiratorisk syndrom coronavirus [MERS-CoV] og SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV og SARS-CoV-2 er højpatogene og forårsager alvorlig nedre luftvejsinfektion7. Før fremkomsten af SARS-CoV-2 var der to epidemiske udbrud forårsaget af CoV’er: SARS-CoV i Guangdong Providence, Kina, fra 2002-2003 med en dødelighed (CFR) på ca. 9,7%; og MERS-CoV i Mellemøsten fra 2012 til i dag med en CFR på ca. 34%7,8. SARS-CoV-2 har en samlet CFR mellem 3,4%-49%, hvor underliggende forhold bidrager til en højere CFR 8,9. Siden opdagelsen i december 2019 i Wuhan, Kina, har SARS-CoV-2 været ansvarlig for over 242 millioner menneskelige infektioner og mere end 4,9 millioner menneskelige dødsfald på verdensplan 7,10,11,12. Siden slutningen af 2020 har nye SARS-CoV-2-varianter af bekymring (VoC) og varianter af interesse (VoI) påvirket virusegenskaber, herunder transmission og antigenicitet 9,13, og den overordnede retning for COVID-19-pandemien. Til behandling af SARS-CoV-2-infektioner er der i øjeblikket kun et USA (USA) Food and Drug Administration (FDA) terapeutisk antiviral (remdesivir) og et lægemiddel til godkendelse af nødbrug (EUA) (baricitinib, der skal administreres i kombination med remdesivir)14. Der er også 6 godkendte MONOKLONALE ANTISTOFFER AF ERE: REGEN-COV (casirivimab og imdevimab, administreret sammen), sotrovimab, tocilizumab og bamlanivimab og etesevimab administreret sammen 15,16,17,18,19. Der er i øjeblikket kun en FDA-godkendt profylaktisk vaccine, Pfizer-BioNTech, og to andre profylaktiske vacciner (Moderna og Janssen) er blevet EUA godkendt 20,21,22,23,24. Men med den ukontrollerede infektionshastighed og fremkomsten af VoC og VoI udgør SARS-CoV-2 stadig en trussel mod menneskers sundhed. Der er derfor et presserende behov for nye tilgange til at identificere effektive profylaktiske midler og terapier til bekæmpelse af SARS-CoV-2-infektion og den stadig igangværende covid-19-pandemi.

At studere SARS-CoV-2 kræver besværlige teknikker og sekundære tilgange til at identificere tilstedeværelsen af virussen i inficerede celler og / eller validerede dyremodeller for infektion. Brugen af omvendt genetik har gjort det muligt for generering af rekombinante vira at besvare vigtige spørgsmål i biologien af virusinfektioner. For eksempel har omvendte genetikteknikker givet midler til at afdække og forstå mekanismerne for virusinfektion, patogenese og sygdom. Ligeledes har omvendte genetikmetoder banet vejen for at konstruere rekombinante vira, der mangler virale proteiner for at forstå deres bidrag til viral patogenese. Derudover er omvendte genetikteknikker blevet anvendt til at generere rekombinante vira, der udtrykker reportergener til in vitro- og in vivo-applikationer, herunder identifikation af profylaktiske og / eller terapeutiske tilgange til behandling af virusinfektioner. Fluorescerende og bioluminescerende proteiner er de mest almindeligt anvendte reportergener på grund af deres følsomhed, stabilitet og lette detektion baseret på forbedring af nye teknologier25,26. In vitro har fluorescerende proteiner vist sig at tjene som en bedre mulighed for lokalisering af vira i inficerede celler, mens luciferaser er mere bekvemme til kvantificeringsundersøgelser 27,28,29. In vivo foretrækkes luciferaser frem for fluorescerende proteiner til hel dyrebilleddannelse, mens fluorescerende proteiner foretrækkes til identifikation af inficerede celler eller ex vivo-billeddannelse 30,31,32. Brugen af indberettende rekombinante vira har fungeret som et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af vira i mange familier, herunder blandt andet flavivirus, enterovirus, alphavirus, lentivirus, arenavirus og influenzavirus 28,33,34,35,36.

For at overvinde behovet for sekundære tilgange til at studere SARS-CoV-2 og karakterisere realtids SARS-CoV-2-infektion in vivo, har vi genereret replikationskompetente rekombinante (r) SARS-CoV-2, der udtrykker bioluminescerende (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner ved hjælp af vores tidligere beskrevne bakterielle kunstige kromosomer (BAC) -baserede omvendte genetik, som opretholdes som en enkelt kopi i E. coli for at minimere toksiciteten af virussekvenser under dens formering i bakterier 37,38. Navnlig viste rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenicitet in vivo. Det høje niveau af Venus-ekspression fra rSARS-CoV-2/Venus gjorde det muligt at detektere virusinfektion i lungerne hos inficerede K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af et in vivo-billeddannelsessystem (IVIS)39. Niveauerne af Venus-ekspression korrelerede godt med virale titere påvist i lungerne, hvilket demonstrerede muligheden for at bruge Venus-ekspression som en gyldig surrogat af SARS-CoV-2-infektion. Ved hjælp af rSARS-CoV-2 /Nluc var vi i stand til at spore dynamikken i virusinfektion i realtid og i længderetningen vurdere SARS-CoV-2-infektion in vivo ved hjælp af den samme IVIS-tilgang i K18 hACE2 transgene mus.

Protocol

Protokoller, der involverer K18 hACE2 transgene mus, blev godkendt af Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) og Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle forsøg følger anbefalingerne i Det Nationale Forskningsråds vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr40. Det passende personlige beskyttelsesudstyr (PPE) er påkrævet, når du arbejder med mus. 1. Brug af K18 hACE2 transgene mus <l…

Representative Results

rSARS-CoV-2/Nluc-infektion hos K18 hACE2 transgene mus (figur 1 og 2)Figur 1A viser en skematisk repræsentation af rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Nluc (nederst), der anvendes til at vurdere infektioner in vivo. Figur 1B viser det skematiske rutediagram, der anvendes til at vurdere rSARS-CoV-2/Nluc-infektionsdynamikken hos K18 hACE2-transgene mus. Fire til seks uger gamle K18 h…

Discussion

Denne protokol demonstrerer muligheden for at bruge disse rSARS-CoV-2-ekspressive reportergener til at overvåge virusinfektioner in vivo. Begge reporter-udtrykkende rekombinante vira giver et glimrende værktøj til at studere SARS-CoV-2-infektioner in vivo. De beskrevne ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) og in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) billeddannelsessystemer repræsenterer en glimrende mulighed for at forstå dynamikken i SARS-CoV-2-infektion, viral patogenese og identificere inficerede cell…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke medlemmer på vores institut (Texas Biomedical Research Institute) for deres indsats for at holde vores faciliteter fuldt operationelle og sikre under COVID-19-pandemien. Vi vil også gerne takke vores Institutional Biosafety Committee (IBC) og spell (IACUC) for at gennemgå vores protokoller på en tidseffektiv måde. Vi takker Dr. Thomas Moran ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for at levere SARS-CoV krydsreaktivt 1C7C7 nucleocapsid (N) protein monoklonalt antistof. SARS-CoV-2-forskning i Martinez-Sobridos laboratorium støttes i øjeblikket af NIAID / NIH-tilskud RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 og R43AI165089-01; Forsvarsministeriet (DoD) giver W81XWH2110095 og W81XWH2110103; San Antonio-partnerskabet for præcisionsterapi; Texas Biomedical Research Institute Forum; University of Texas Health Science Center i San Antonio; San Antonio Medical Foundation; og af Center for Forskning i Influenza Patogenese og Transmission (CRIPT), et NIAID-finansieret Center of Excellence for Influenza Research and Response (CEIRR, kontrakt nr. 75N93021C00014).

Materials

0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. V’Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. . Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021)
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O’Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 – Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine – United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine – United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Keywords: Live ImagingQuantificationViral InfectionK18 HACE2 Transgenic MiceReporter-expressing Recombinant SARS-CoV-2In VivoEx VivoFluorescenceBioluminescenceLuciferaseIVISLungsNecropsy
check_url/it/63127?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image