Выделение эндотелиальных клеток из просвета сонных артерий мыши для одноклеточных мультиомных экспериментов
Summary
Представлен метод выделения эндотелиальных клеток и ядер из просвета сонных артерий мышей, подвергающихся воздействию стабильных или нарушенных условий течения для проведения экспериментов с одноклеточной омикой.
Abstract
Атеросклероз – это воспалительное заболевание артериальных областей, подверженных нарушенному кровотоку (d-потоку). D-поток регулирует экспрессию генов в эндотелии на транскриптомном и эпигеномном уровнях, что приводит к проатерогенным реакциям. Недавно были проведены исследования секвенирования одноклеточной РНК (scRNAseq) и одноклеточного анализа для транспозазного секвенирования хроматина (scATACseq) для определения изменений доступности транскриптома и хроматина при одноклеточном разрешении с использованием модели частичного лигирования сонной артерии мыши (PCL). Поскольку эндотелиальные клетки (ЭК) представляют собой незначительную долю от общего количества клеточных популяций в стенке артерии, для получения одноклеточных препаратов, обогащенных ЭК, был использован метод люминального сбраживания. Для этого исследования мышей подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в левой сонной артерии (LCA) при использовании правой сонной артерии (RCA) в качестве контроля. Сонные артерии были рассечены через два дня или две недели после операции PCL. Просвет каждой сонной артерии подвергали перевариванию коллагеназы, и получали обогащенные эндотелием одиночные клетки или одиночные ядра. Эти одноклеточные и одноядерные препараты были впоследствии штрих-кодированы с использованием 10-кратной микрофлюидной установки Genomics. Штрих-кодированные одиночные клетки и одноядерные ядра затем использовались для подготовки РНК, генерации библиотеки и секвенирования на высокопроизводительном секвенаторе ДНК. После обработки биоинформатики наборы данных scRNAseq и scATACseq идентифицировали различные типы клеток из просветного пищеварения, в основном состоящие из ЭК. Гладкомышечные клетки, фибробласты и иммунные клетки также присутствовали. Этот метод обогащения EC помог понять влияние кровотока на эндотелий, что могло быть затруднено при методе полного переваривания артерий. Метод одноклеточного препарата, обогащенный ЕС, может быть использован для проведения одноклеточных омических исследований у EC-нокаутов и трансгенных мышей, где влияние кровотока на эти гены не изучалось. Важно отметить, что этот метод может быть адаптирован для выделения обогащенных ЕС одиночных клеток из эксплантов артерий человека для выполнения аналогичных механистических исследований.
Introduction
Эта лаборатория ранее продемонстрировала, что индукция d-потока приводит к быстрому и бурному развитию атеросклероза у гиперлипидемических мышей 1,2. Новая мышиная модель d-потока-индуцированного атеросклероза была возможна с использованием операции частичного перевязки сонной артерии (PCL) 3. Хирургия PCL вызывает низкое и колебательное состояние кровотока или d-потока в перевязанной левой сонной артерии (LCA). Напротив, контралатеральная правая сонная артерия (RCA) продолжает сталкиваться со стабильным ламинарным потоком (s-flow). Ранее, чтобы понять влияние d-потока на эндотелиальные клетки, сонные артерии были рассечены после операции частичной перевязки и промыты фенолом и гуанидином изотиоцианатным агентом (метод промывки люминальной РНК / ДНК)2,4, который обеспечивал обогащенные эндотелием «объединенные объемные» РНК или ДНК. Эти объединенные объемные РНК или ДНК затем обрабатывались для транскриптомных исследований или эпигеномных исследований метилома ДНК, соответственно 4,5,6. Эти исследования помогли обнаружить множественные чувствительные к потоку гены и микроРНК, роль которых в эндотелиальной биологии и атеросклерозе была широко исследована 4,6,7.
Однако, несмотря на обогащение эндотелия, эти объемные исследования РНК/ДНК не смогли различить конкретную роль каждого типа клеток в стенке артерии при d-поток-индуцированном атеросклерозе. Для преодоления этогоограничения были проведены исследования обогащенной эндотелиалом одноклеточной (sc) изоляции и секвенирования scRNA и scATAC. Для этого мышей C57Bl6 подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в LCA при использовании RCA, подвергающейся воздействию s-потока, в качестве контроля. Через два дня или две недели после операции PCL мышей приносили в жертву, а сонные артерии рассекали и очищали. Просвет как LCA, так и RCA был наполнен коллагеназой, а люминальные коллагеназы перевариваются, содержащие EC в виде значительной фракции и другие артериальные клетки. Одноклеточную суспензию (scRNAseq) или одноядерную суспензию (scATACseq) готовили и штрих-кодировали уникальными идентификаторами для каждой клетки или ядра с использованием 10-кратной установки геномики. РНК подвергали подготовке и секвенированию библиотеки кДНК.
Наборы данных scRNAseq и scATACseq были обработаны с использованием программного обеспечения Cell Ranger Single-Cell и дополнительно проанализированы пакетами Seurat и Signac R 9,10. Каждой клетке и ядру был присвоен тип клеток из этих анализов и сгруппирован в тип клеток на основе маркерных генов и уникальных паттернов экспрессии генов. Результаты scRNAseq и scATACseq показали, что эти одноклеточные препараты обогащены ЭК, а также содержат гладкомышечные клетки (SMC), фибробласты и иммунные клетки.
Дальнейший анализ показал, что популяция ЕС в просветном пищеварении сильно расходится и пластична (8 различных кластеров ЕС) и реагирует на кровоток. Самое главное, что эти результаты показали, что d-flow перепрограммирует EC от атеро-защищенного противовоспалительного фенотипа к проатерогенным фенотипам, включая провоспалительный, эндотелиальный переход в мезенхимальный переход, эндотелиальный стволовый / предшественник клеточный переход и, что самое удивительное, эндотелиальный клеточный переход. Кроме того, данные scATACseq показывают новые изменения доступности хроматина, зависящие от потока, и сайты связывания транскрипционного фактора в масштабах всего генома, которые составляют основу нескольких новых гипотез. Методология и протокол подготовки одиночных эндотелиальных клеток для одноклеточных мультиомических исследований из сонных артерий мышей подробно описаны ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен подробный протокол выделения одноклеточных препаратов из сонных артерий мыши. Влияние d-потока на эндотелиальные клетки может быть точно изучено, если операция PCL выполнена правильно. Крайне важно правильно идентифицировать ветви общей сонной артерии, т?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием грантов Национальных институтов здравоохранения HL119798, HL095070 и HL139757 для HJ. HJ также поддерживается профессорской кафедрой Уоллеса Х. Култера. Услуги, предоставляемые Emory Integrated Genomics Core (EIGC), субсидировались Медицинской школой Университета Эмори, а также частично поддерживались Альянсом клинических и трансляционных наук Джорджии Национальных институтов здравоохранения под номером премии. УЛ1ТР002378. Содержание, представленное выше, является исключительной ответственностью авторов и не отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Riferimenti
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O’Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
