Isolement de cellules endothéliales de la lumière des artères carotides de souris pour des expériences multi-omiques unicellulaires
Summary
Nous présentons une méthode pour isoler les cellules endothéliales et les noyaux de la lumière des artères carotides de souris exposées à des conditions d’écoulement stables ou perturbées pour effectuer des expériences omiques unicellulaires.
Abstract
L’athérosclérose est une maladie inflammatoire des régions artérielles exposées à un flux sanguin perturbé (d-flow). Le flux D régule l’expression des gènes dans l’endothélium aux niveaux transcriptomique et épigénomique, ce qui entraîne des réponses proathérogènes. Récemment, des études de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et de dosage unicellulaire pour le séquençage de la chromatine accessible par transposase (scATACseq) ont été réalisées pour déterminer les changements transcriptomiques et d’accessibilité de la chromatine à une résolution unicellulaire à l’aide du modèle de ligature partielle des carotides (LCP) chez la souris. Comme les cellules endothéliales (CE) représentent une fraction mineure des populations cellulaires totales dans la paroi artérielle, une méthode de digestion luminale a été utilisée pour obtenir des préparations unicellulaires enrichies en CE. Pour cette étude, des souris ont été soumises à une chirurgie PCL pour induire un flux d dans l’artère carotide gauche (ACL) tout en utilisant l’artère carotide droite (RCA) comme témoin. Les artères carotides ont été disséquées deux jours ou deux semaines après la chirurgie du LCP. La lumière de chaque carotide a été soumise à une digestion de collagénase et des cellules uniques enrichies en endothéliales ou des noyaux simples ont été obtenus. Ces préparations unicellulaires et mononucléiformes ont ensuite été codées à barres à l’aide d’une configuration microfluidique 10x Genomics. Les cellules uniques et les noyaux uniques codés à barres ont ensuite été utilisés pour la préparation de l’ARN, la génération de bibliothèques et le séquençage sur un séquenceur d’ADN à haut débit. Après le traitement bioinformatique, les ensembles de données scRNAseq et scATACseq ont identifié divers types de cellules à partir de la digestion luminale, principalement constituées de CE. Des cellules musculaires lisses, des fibroblastes et des cellules immunitaires étaient également présents. Cette méthode d’enrichissement de la CE a aidé à comprendre l’effet du flux sanguin sur l’endothélium, ce qui aurait pu être difficile avec la méthode de digestion de l’artère totale. La méthode de préparation unicellulaire enrichie en CE peut être utilisée pour effectuer des études omiques unicellulaires chez des souris knockouts EC et transgéniques lorsque l’effet du flux sanguin sur ces gènes n’a pas été étudié. Il est important de noter que cette technique peut être adaptée pour isoler des cellules uniques enrichies en CE à partir d’explants d’artères humaines afin d’effectuer des études mécanistiques similaires.
Introduction
Ce laboratoire a précédemment démontré que l’induction du flux d conduit à un développement rapide et robuste de l’athérosclérose chez les souris hyperlipidémiques 1,2. Le nouveau modèle murin d’athérosclérose induite par le flux d a été possible en utilisant la chirurgie de ligature carotidienne partielle (LCP) 3. La chirurgie PCL induit un débit sanguin faible et oscillatoire ou un flux d dans l’artère carotide gauche ligaturée (ACL). En revanche, l’artère carotide droite controlatérale (ARC) continue de faire face à un flux laminaire stable (s-flux). Auparavant, pour comprendre l’effet du flux d sur les cellules endothéliales, les artères carotides étaient disséquées après une chirurgie de ligature partielle et rincées avec un agent de lyse à base de phénol et de guanidine isothiocyanate (méthode de rinçage de l’ARN luminal / ADN)2,4, qui fournissait des ARN ou des ADN en vrac enrichis en endothéliales. Ces ARN ou ADN groupés en vrac ont ensuite été traités pour des études transcriptomiques ou des études de méthylome d’ADN épigénomique, respectivement 4,5,6. Ces études ont permis de découvrir de multiples gènes et microARN sensibles aux flux dont les rôles dans la biologie endothéliale et l’athérosclérose ont été largement étudiés 4,6,7.
Cependant, malgré l’enrichissement endothélial, ces études d’ARN / ADN en vrac n’ont pas pu distinguer le rôle spécifique de chaque type de cellule dans la paroi artérielle dans l’athérosclérose induite par le flux d. Des études d’isolement de cellules uniques enrichies en endothéliales (sc) et de séquençage scRNA et scATAC ont été réalisées pour surmonter cette limitation8. Pour cela, les souris C57Bl6 ont été soumises à la chirurgie PCL pour induire un flux d dans l’ACL tout en utilisant le RCA exposé au flux s comme témoin. Deux jours ou deux semaines après la chirurgie du LCP, les souris ont été sacrifiées et les carotides ont été disséquées et nettoyées. La lumière des ACL et des ARC a été perfusée avec de la collagénase, et les digestions de collagénase luminale contenant des CE comme une fraction significative et d’autres cellules artérielles ont été collectées. La suspension unicellulaire (scRNAseq) ou la suspension mononucléiforme (scATACseq) ont été préparées et codées à barres avec des identifiants uniques pour chaque cellule ou noyau à l’aide d’une configuration génomique 10x. Les ARN ont été soumis à la préparation d’une banque d’ADNc et séquencés.
Les ensembles de données scRNAseq et scATACseq ont été traités à l’aide du logiciel Cell Ranger Single-Cell Software et analysés plus en détail par les packages Seurat et Signac R 9,10. Chaque cellule et noyau s’est vu attribuer un type de cellule à partir de ces analyses et a été regroupé dans le type cellulaire en fonction des gènes marqueurs et des profils d’expression génique uniques. Les résultats du scRNAseq et du scATACseq ont démontré que ces préparations unicellulaires sont enrichies en EC et contiennent également des cellules musculaires lisses (SMC), des fibroblastes et des cellules immunitaires.
Une analyse plus approfondie a révélé que la population EC dans la digestion luminale est très divergente et plastique (8 grappes EC différentes) et sensible au flux sanguin. Plus important encore, ces résultats ont démontré que le flux d reprogramme les CE d’un phénotype anti-inflammatoire protégé par l’athéros, à des phénotypes pro-athérogènes, y compris la transition pro-inflammatoire, endothéliale à mésenchymateuse, la transition endothéliale souche / cellule progénitrice, et plus surprenant, la transition endothéliale à cellule immunitaire. En outre, les données de scATACseq révèlent de nouveaux changements d’accessibilité de la chromatine dépendants du flux et des sites de liaison aux facteurs de transcription à l’échelle du génome, qui constituent la base de plusieurs nouvelles hypothèses. La méthodologie et le protocole de préparation de cellules endothéliales uniques pour les études multi-omiques unicellulaires des artères carotides de souris sont détaillés ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article fournit un protocole détaillé pour isoler les préparations unicellulaires des artères carotides de souris. L’influence du flux d sur les cellules endothéliales peut être étudiée avec précision si la chirurgie PCL est effectuée correctement. Il est crucial d’identifier correctement les branches de la carotide commune, telles que la carotide externe, la carotide interne, l’artère occipitale et l’artère thyroïdienne supérieure. La validation des schémas d’écoulement par échogr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le financement des subventions HL119798, HL095070 et HL139757 des National Institutes of Health à HJ. HJ est également soutenu par le Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Les services fournis par l’Emory Integrated Genomics Core (EIGC) ont été subventionnés par la faculté de médecine de l’Université Emory et ont également été partiellement soutenus par la Georgia Clinical and Translational Science Alliance des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution. UL1TR002378. Le contenu fourni ci-dessus relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflète pas les opinions officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Riferimenti
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