Summary

बिलियोपैन्क्रियाटिक डक्ट में सोडियम टॉरोकोलेट के प्रतिगामी इंजेक्शन का उपयोग करके माउस गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ मॉडल की स्थापना

Published: April 01, 2022
doi:

Summary

गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ के एक माउस मॉडल यहाँ वर्णित है। यहां प्रस्तुत प्रक्रिया बहुत तेज, सरल और सुलभ है, जिससे संभावित रूप से आणविक तंत्र के अध्ययन और एक सुविधाजनक तरीके से तीव्र अग्नाशयशोथ में विभिन्न चिकित्सीय हस्तक्षेपों की अनुमति मिलती है।

Abstract

तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी), विशेष रूप से गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एसएपी) का प्रसार, सालाना युवा आयु समूहों में बढ़ रहा है। हालांकि, वर्तमान नैदानिक अभ्यास में प्रभावी उपचार की कमी है। ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों और उनके छोटे आकार की आसान पहुंच के साथ, जो विवो मूल्यांकन में आवश्यक दवाओं की न्यूनतम खुराक की अनुमति देता है, चूहों में एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक मॉडल एपी अनुसंधान के लिए पसंद किया जाता है। इसके अलावा, सोडियम टॉरोकोलेट (टीसी) के माध्यम से प्रेरित एसएपी वर्तमान में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले और सबसे अच्छी विशेषता वाले मॉडलों में से एक है। इस मॉडल को एपी की प्रक्रिया के दौरान उपन्यास उपचार और संभावित आणविक घटनाओं के लिए जांच की गई है। यहां, हम सोडियम टॉरोकोलेट और एक साधारण घर का बना माइक्रोसिरिंज का उपयोग करके एक एपी माउस मॉडल की पीढ़ी प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम बाद के हिस्टोलॉजी और सीरोलॉजिकल परीक्षण के लिए पद्धति भी प्रदान करते हैं।

Introduction

तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) अग्न्याशय की एक तीव्र सूजन है जो बाद के डक्टल डिस्टेंशन और अग्न्याशय ऑटोडाइजेशन के साथ मुख्य अग्नाशयी वाहिनी की रुकावट की विशेषता है जो इसके असामान्य रूप से सक्रिय एंजाइमों द्वारा है। इसकी नैदानिक अभिव्यक्तियों में स्थानीय या प्रणालीगत सूजन, पेट में दर्द, और सीरम एमाइलेज 1,2 की ऊंचाई शामिल है। गंभीरता वर्गीकरण 3 के अनुसार, एपी हल्के, मध्यम और गंभीर रूपों में मौजूद हो सकता है, और उनमें से, गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एसएपी) 30% से अधिक की उच्च मृत्यु दर के कारण सबसे अधिक संबंधित स्थिति है। संयुक्त राज्य अमेरिका में, एपी अस्पताल में भर्ती होने के सबसे आम कारणों में से एक है, जो 200,000 से अधिक रोगियों को प्रभावित करता है। इसके अलावा, एपी, विशेष रूप से एसएपी, सालाना बढ़ रहा है और युवा आयु समूहों को प्रभावित कर रहा है। हालांकि, वर्तमान नैदानिक अभ्यास 6,7 में प्रभावी उपचार विकल्पों की कमी है। इसलिए, एपी में शामिल आणविक तंत्र का पता लगाना आवश्यक है, जिससे उपचार में सुधार की सुविधा मिलती है।

एपी में शामिल तंत्र का अध्ययन करने और विभिन्न उपचार पद्धतियों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक पशु मॉडल की आवश्यकता होती है। ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों और उनके छोटे आकार की आसान पहुंच के साथ, जो विवो मूल्यांकन में आवश्यक दवाओं की खुराक को कम करता है, चूहों को एपी अनुसंधान के लिए पसंद किया जाता है। इसलिए, एपी के कई मॉडल चूहों 8,9 में विकसित किए गए हैं

caerulein10 के अंतःशिरा प्रशासन के माध्यम से प्रेरित एक हल्के अग्नाशयशोथ चूहे मॉडल से काम करते हुए, Niederau et al. एक ही दवा और इंजेक्शन route11 का उपयोग कर प्रेरित acinar सेल परिगलन के साथ प्रस्तुत एक एसएपी माउस मॉडल विकसित किया। यद्यपि इस मॉडल में noninvasiveness, तेजी से प्रेरण, व्यापक reproducibility, और प्रयोज्यता सहित कई फायदे हैं, प्रमुख नुकसान यह है कि ज्यादातर मामलों में एपी का केवल एक हल्का रूप विकसित किया जाता है, जिससे इसकी नैदानिक प्रासंगिकता सीमित हो जाती है। अल्कोहल को एपी के प्रमुख etiologic कारकों में से एक माना जाता है; हालांकि, Foitzik et al. ने बताया कि यह अग्नाशय की चोट का कारण बनता है जब अन्य कारकों के साथ संयुक्त होता है, जैसे कि एक्सोक्राइन हाइपरस्टिमुलेशन 12। इसके अलावा, हालांकि विभिन्न प्रशासन मार्गों के माध्यम से विकसित शराब-प्रेरित एपी मॉडल, और दवा की खुराक 13,14,15 की सूचना दी गई है, उनका प्रमुख नुकसान उन्हें पुन: उत्पादन करने में कठिनाई है। एल-आर्जिनिन के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन भी चूहों 16 में एपी को प्रेरित कर सकते हैं; हालांकि, इसकी कम नैदानिक प्रासंगिकता इसके आवेदन में बाधा डालती है। टॉरोकोलेट, एक पित्त नमक, पहली बार 1965 में Creutzfeld et al. द्वारा अग्नाशयी वाहिनी infusion17 के माध्यम से मानव एपी जैसी स्थिति को प्रेरित करने के लिए प्रस्तावित किया गया था। यद्यपि pathophysiology18,19 में इसकी नैदानिक प्रासंगिकता के बारे में विवाद मौजूद हैं, टॉरोकोलेट-प्रेरित अग्नाशयशोथ एसएपी के लिए एक अपरिहार्य मॉडल बना हुआ है।

जैसा कि यह मॉडल महसूस करना आसान है और चूहों में भी प्रभावी है, यह अब विवो अध्ययन में छोटे जानवरों के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले एपी मॉडल में से एक है। Perides et al. ने चूहों 20 में SAP को प्रेरित करने के लिए सोडियम टॉरोकोलेट (टीसी) को नियोजित किया, जो इसकी विकृति को समझने के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। आनुवांशिक संशोधन तकनीकों के साथ संयुक्त, इस मॉडल ने हमें एपी में शामिल कई विशिष्ट जीनों की पुष्टि करने की अनुमति दी है। उदाहरण के लिए, Bicozo et al. से पता चला है कि CD38 जीन के एक नॉकआउट ने टीसी-इन्फ्यूजन अग्नाशयशोथ के एक मॉडल के खिलाफ संरक्षित किया और इंट्रासेल्युलर Ca2 + सिग्नलिंग 21 में परिवर्तन के लिए तंत्र को जिम्मेदार ठहराया। Fanczal et al. माउस अग्नाशय acinar और डक्टल कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में TRPM2 अभिव्यक्ति के शारीरिक निहितार्थ की जांच की, और TRPM2 नॉकआउट mice22 में TC-प्रेरित SAP की कम गंभीरता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, यह मॉडल विवो में कई उपन्यास दवाओं का परीक्षण करने का एक सरल और प्रभावी तरीका भी प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इस विधि ने कैफीन 23, डिहाइड्रोकोलिक एसिड 24, और विभिन्न एंटीऑक्सिडेंट और एंटीकोआगुलंट्स 25,26 के चिकित्सीय प्रभावों के सत्यापन को सक्षम किया। यह सबूत टीसी-प्रेरित एसएपी मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा को दर्शाता है। हालांकि Wittel et al. ने एक समान माउस मॉडल 27 का वर्णन किया है, कार्यान्वयन प्रक्रियाओं पर विवरण की कमी के परिणामस्वरूप निष्कर्षों को पुन: पेश करने में असमर्थता हो सकती है। इस लेख में, हम एक साधारण होममेड माइक्रोसिरिंज का उपयोग करने और टीसी-प्रेरित एसएपी का अध्ययन करने के तरीकों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिससे न केवल एपी के रोगजनन और उपचार के आगे के अध्ययन के लिए संभव मार्गदर्शन प्रदान किया जाता है, बल्कि कई अन्य पदार्थों के लिए पूरी तरह से अनुकूलनीय प्रयोगात्मक विधि के लिए भी।

Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों को Soochow University की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं को पूर्ण संज्ञाहरण के तहत किया गया था। एनाल्जेसिक का उपयोग पिछले साहित्य 28,29…

Representative Results

ऊपर दिए गए निर्देशों का सावधानीपूर्वक पालन करके, हमने लगभग 40 मिनट की औसत सर्जरी अवधि प्राप्त की। चूहे थोड़े निष्क्रिय थे और क्रमशः 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे के ऑपरेशन के बाद लगभग 0.5-1.75 ग्राम, 0.85-1.85 ग्राम और 0.5-4.73 ग?…

Discussion

टीसी प्रेरित एसएपी मॉडल एक उत्कृष्ट अनुसंधान उपकरण है। जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है, इस मॉडल को विशिष्ट उपकरणों को नियोजित किए बिना सामान्य प्रयोगशालाओं में बहुत आसानी से महसूस किया जाता है। जब…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम निम्नलिखित अनुदानों से समर्थन के लिए आभारी हैं: NCRCH [2020WSA01] का एक ट्रांसलेशनल रिसर्च ग्रांट, युवा विद्वानों के लिए स्वास्थ्य के Suzhou आयोग से एक KJXW वैज्ञानिक अनुदान [KJXW2020002], Suzhou सिटी की एक विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (SKY2021038 और SKJY2021050), Jiangsu उच्च शिक्षा संस्थानों (PAPD) के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास से एक अनुदान ( BED2) और एक प्राथमिक अनुसंधान योजना (BED2)

Materials

0.5% iodophor Shanghai Likang Disinfectant 310102 4 mL/mouse
0.9% sodium chloride Sinopharm Group Co., Ltd. 10019318 0.8 mL/mouse
1% Pentobarbital sodium Sigma P3761 0.2 -0.25 mL/mouse
25 μL flat tip Microliter syringe Gaoge, Shanghai A124019
4% Paraformaldehyde Beyotime, Nantong, China P0099-500ml
5% sodium taurocholate (TC) Aladdin S100834-5g 10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) Cheng-He 20093
75% alcohol Sinopharm Group Co., Ltd. 10009218 4 mL/mouse
8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) Cheng-He 19064
ALT Activity Assay Kit EPNK, Anhui, China ALT0012
Amylase Assay Kit EPNK, Anhui, China AMY0012
Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) Cheng-He HC-X022
aspen shavings or shreds for mouse bedding Beijing Vital River Laboratory Animal Technology VR03015
AST Activity Assay Kit EPNK, Anhui, China AST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit EPNK, Anhui, China BUN0011
C57BL/6 mouse Beijing Vital River Laboratory Animal Technology 213
Creatine Assay Kit EPNK, Anhui, China CRE0012
Feature microtome blade Beyotime, Nantong, China E0994
Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. JC3901
Lipase Assay Kit Jiancheng, Nanjing, China A054-2-1
Microtome Leica biosystem, Germany RM2245
Mindray biochemistry analyzer Mindray, Shenzhen, China BS-420
MPO Assay Kit Jiancheng, Nanjing, China A044-1-1
Normal mouse chow Trophic, Nantong, China LAD 1000
Phosphate buffered saline Beyotime, Nantong, China C0221A
Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. W40130
Straight or curved forceps (11.0 cm) Cheng-He HC-X091A or HC-X090A
Straight Scissors (10.0 cm) Cheng-He, Ningbo, China HC-J039102
Thermo Scientific Centrifuge Thermo Scientific, USA Multifuge X1R

Riferimenti

  1. Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
  2. Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
  3. Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
  4. Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
  5. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
  6. Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227 (2019).
  7. James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
  8. Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
  9. Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
  10. Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
  11. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
  12. Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
  13. Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
  14. Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
  15. Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
  16. Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
  17. Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
  18. Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
  19. Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
  20. Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  21. Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
  22. Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
  23. Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
  24. Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
  25. Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
  26. Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
  27. Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
  28. Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
  29. Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
  30. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
  31. Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
  32. Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
  33. Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
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Citazione di questo articolo
Zhou, X., Chen, H., Wei, X., He, Y., Xu, C., Weng, Z. Establishment of a Mouse Severe Acute Pancreatitis Model using Retrograde Injection of Sodium Taurocholate into the Biliopancreatic Duct. J. Vis. Exp. (182), e63129, doi:10.3791/63129 (2022).

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