Creazione di un modello di pancreatite acuta grave del topo mediante iniezione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto biliopancreatico
Summary
Un modello murino di pancreatite acuta grave è descritto qui. La procedura qui presentata è molto rapida, semplice e accessibile, consentendo così potenzialmente lo studio dei meccanismi molecolari e dei diversi interventi terapeutici nella pancreatite acuta in modo conveniente.
Abstract
La prevalenza della pancreatite acuta (AP), in particolare della pancreatite acuta grave (SAP), è in aumento nei gruppi di età più giovani ogni anno. Tuttavia, vi è una mancanza di trattamenti efficaci nell’attuale pratica clinica. Con la facile accessibilità dei ceppi transgenici e knockout e le loro piccole dimensioni, che consentono dosi minime di farmaci necessari per la valutazione in vivo , un modello sperimentale ben consolidato nei topi è preferito per la ricerca AP. Inoltre, il SAP indotto attraverso il taurocolato di sodio (TC) è attualmente uno dei modelli più utilizzati e meglio caratterizzati. Questo modello è stato studiato per nuove terapie e possibili eventi molecolari durante il processo di AP. Qui, presentiamo la generazione di un modello di topo AP utilizzando taurocolato di sodio e una semplice microsiringa fatta in casa. Inoltre, forniamo anche la metodologia per i successivi test istologici e sierologici.
Introduction
La pancreatite acuta (AP) è un’infiammazione acuta del pancreas caratterizzata da ostruzione del dotto pancreatico principale con successiva distensione duttale e autodigestione del pancreas da parte dei suoi enzimi anormalmente attivati. Le sue manifestazioni cliniche includono infiammazione locale o sistemica, dolore addominale e aumento dell’amilasi sierica1,2. Secondo la classificazione di gravità3, l’AP può presentarsi in forme lievi, moderate e gravi e, tra queste, la pancreatite acuta grave (SAP) è la condizione più preoccupante a causa del suo alto tasso di mortalità superiore al 30%4. Negli Stati Uniti, l’AP è uno dei motivi più comuni per il ricovero in ospedale, che colpisce oltre 200.000 pazienti5. Inoltre, AP, in particolare SAP, aumenta ogni anno e colpisce le fasce di età più giovani6. Tuttavia, vi è una mancanza di opzioni di trattamento efficaci nella pratica clinica attuale6,7. Pertanto, è necessario esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nell’AP, facilitando così il miglioramento del trattamento.
Modelli animali sperimentali consolidati sono necessari per studiare i meccanismi coinvolti nell’AP e valutare l’efficacia delle diverse modalità di trattamento. Con la facile accessibilità dei ceppi transgenici e knockout e le loro piccole dimensioni, che riducono al minimo le dosi di farmaci necessarie per la valutazione in vivo, i topi sono preferiti per la ricerca AP. Pertanto, diversi modelli di AP sono stati sviluppati nei topi8,9.
Lavorando da un modello di ratto di pancreatite lieve indotto attraverso la somministrazione endovenosa di caeruleina10, Niederau et al. hanno sviluppato un modello murino SAP presentato con necrosi a cellule acinari indotta utilizzando lo stesso farmaco e via di iniezione11. Sebbene questo modello possieda diversi vantaggi, tra cui non invasività, induzione rapida, ampia riproducibilità e applicabilità, il principale svantaggio è che nella maggior parte dei casi viene sviluppata solo una forma lieve di AP, limitando così la sua rilevanza clinica. L’alcol è considerato uno dei principali fattori eziologici di AP; tuttavia, Foitzik et al. hanno riferito che provoca lesioni pancreatiche solo se combinato con altri fattori, come l’iperstimolazione esocrina12. Inoltre, sebbene siano stati riportati modelli ap indotti da alcol sviluppati attraverso diverse vie di somministrazione e dosi di farmaci13,14,15, il loro principale svantaggio è la difficoltà a riprodurli. La somministrazione intraperitoneale di L-arginina può anche indurre AP nei topi16; tuttavia, la sua bassa rilevanza clinica ne ostacola l’applicazione. Il taurocolato, un sale biliare, è stato proposto per la prima volta da Creutzfeld et al. nel 1965 per indurre una condizione simile all’AP umano tramite infusione del dotto pancreatico17. Sebbene esistano controversie sulla sua rilevanza clinica in fisiopatologia18,19, la pancreatite indotta da taurocolato rimane un modello indispensabile per SAP.
Poiché questo modello è semplice da realizzare ed è efficace anche nei topi, è ora uno dei modelli AP più utilizzati per gli studi in vivo sui piccoli animali. Perides et al. hanno impiegato taurocolato di sodio (TC) per indurre SAP nei topi20, fornendo approfondimenti per comprendere la sua patologia. Combinato con tecniche di modificazione genetica, questo modello ci ha permesso di confermare diversi geni specifici coinvolti nell’AP. Ad esempio, Bicozo et al. hanno dimostrato che un knockout del gene CD38 proteggeva contro un modello di pancreatite da infusione TC e attribuiva i meccanismi alle alterazioni nella segnalazione intracellulare di Ca2+21. Fanczal et al. hanno studiato l’implicazione fisiologica dell’espressione di TRPM2 nella membrana plasmatica delle cellule acinari e duttali pancreatiche di topo e hanno dimostrato una ridotta gravità del SAP indotto da TC nei topi knockout TRPM222. Inoltre, questo modello fornisce anche un modo semplice ed efficace per testare molti nuovi farmaci in vivo. Ad esempio, questo metodo ha permesso la convalida degli effetti terapeutici della caffeina23, dell’acido deidrocolico24 e di vari antiossidanti e anticoagulanti25,26. Questa evidenza dimostra la versatilità del modello SAP indotto da TC. Sebbene Wittel et al. abbiano descritto un modello murino simile27, la mancanza di dettagli sulle procedure di implementazione potrebbe comportare l’incapacità di riprodurre i risultati. In questo articolo, ci concentriamo sui metodi che utilizzano una semplice microsiringa fatta in casa e studiamo il SAP indotto da TC, fornendo così una possibile guida non solo per ulteriori studi sulla patogenesi e il trattamento dell’AP, ma anche per un metodo sperimentale perfettamente adattabile per molte altre sostanze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello SAP indotto da TC è un eccellente strumento di ricerca. Come mostrato in questo studio, questo modello è molto facilmente realizzabile nei laboratori generali senza utilizzare dispositivi specifici. Se utilizzato in combinazione con l’istologia e l’analisi biochimica, fornisce un approccio basato sui costi (reagenti economici) e sul risparmio di tempo (finestra temporale di 24 ore) per indurre e valutare AP. La regolazione della concentrazione di TC offre anche la possibilità di produrre AP lieve e moderato…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per il sostegno delle seguenti sovvenzioni: una sovvenzione di ricerca traslazionale di NCRCH [2020WSA01], una sovvenzione scientifica KJXW della Commissione di salute di Suzhou per giovani studiosi [KJXW2020002], un piano scientifico e tecnologico della città di Suzhou (SKY2021038 e SKJY2021050), una sovvenzione del priority academic program development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) e un piano di ricerca primaria e sviluppo sociale della provincia di Jiangsu (BE2018659).
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
Riferimenti
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