मनका-समर्थित लिपिड बाईलेयर्स की तैयारी टी सेल प्रतिरक्षा Synapses के कण आउटपुट का अध्ययन करने के लिए
Summary
यहां हम मनका-समर्थित लिपिड बाईलेयर्स का उपयोग करके सिंथेटिक एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं के चरणबद्ध पुनर्गठन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और सक्रिय टी कोशिकाओं से सिनैप्टिक आउटपुट से पूछताछ करने के लिए उनके उपयोग करते हैं।
Abstract
एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं (एपीसी) शारीरिक संपर्क में लगी टी कोशिकाओं के लिए तीन सक्रिय संकेत प्रस्तुत करती हैं: 1) एंटीजन, 2) कोस्टिमुलेशन / कोरप्रेसन, और 3) घुलनशील साइटोकिन्स। टी कोशिकाएं सक्रियण के जवाब में दो प्रकार के प्रभावक कणों को जारी करती हैं: ट्रांस-सिनैप्टिक पुटिकाओं (टीएसवी) और सुपरमोलेक्यूलर हमले के कण, जो क्रमशः अंतरकोशिकीय दूतों को स्थानांतरित करते हैं और साइटोटॉक्सिसिटी की मध्यस्थता करते हैं। इन संस्थाओं को टी कोशिकाओं के साथ शारीरिक संपर्क में लगे एपीसी द्वारा जल्दी से आंतरिक किया जाता है, जिससे उनका लक्षण वर्णन चुनौतीपूर्ण हो जाता है। यह पेपर इन ट्रांस-सिनैप्टिक कणों को पकड़ने और विश्लेषण करने के लिए एंटीजन-प्रस्तुत सेल (एपीसी) मिमेटिक्स के रूप में मनका-समर्थित लिपिड बाईलेयर्स (बीएसएलबी) का निर्माण और उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसके अलावा वर्णित सेल सतहों पर प्रोटीन घनत्व के पूर्ण माप के लिए प्रोटोकॉल, इस तरह के शारीरिक स्तरों के साथ BSLBs के पुनर्गठन, और टी कोशिकाओं द्वारा सिनैप्टिक कण रिलीज पर नज़र रखने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री प्रक्रिया। इस प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत प्रोटीन, जटिल लिगैंड मिश्रण, रोगज़नक़ वायरस निर्धारकों और टी कोशिकाओं के प्रभावकारी आउटपुट पर दवाओं के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें सहायक टी कोशिकाएं, साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट्स, नियामक टी कोशिकाएं और चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर-एक्सप्रेसिंग टी कोशिकाएं (CART) शामिल हैं।
Introduction
इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स (आईएस) एक महत्वपूर्ण आणविक संरचना है जो भौतिक संपर्क में लगी कोशिकाओं के इंटरफ़ेस पर बनाई गई है जो जुक्सट्राइन जानकारी के विनियमित आदान-प्रदान की सुविधा प्रदान करती है। साहित्य में विभिन्न आईएस का वर्णन किया गया है, और सबूतों के बढ़ते शरीर से पता चलता है कि ये आणविक केंद्र सेलुलर नेटवर्क की एक संरक्षित विशेषता हैं। बी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, डेंड्रिटिक कोशिकाओं, मैक्रोफेज और टी कोशिकाओं सहित विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं, अल्पकालिक संपर्कों की असेंबली के माध्यम से जानकारी का आदान-प्रदान करती हैं। Multiomic अध्ययन ल्यूकोसाइट्स और स्ट्रोमल कोशिकाओं के उपन्यास सबसेट की समझ को आगे बढ़ा रहे हैं रोगजनक सेलुलर नेटवर्क ड्राइविंग और अज्ञात कार्यों के साथ सतह प्रोटीन व्यक्त करते हैं। सिंथेटिक एपीसी के रूप में, बीएसएलबी टी कोशिकाओं द्वारा सक्रिय संकेतों के एकीकरण में व्यक्तिगत प्रोटीन की कार्यात्मक भूमिका की प्रत्यक्ष जांच की अनुमति देते हैं, अर्थात् एंटीजन और कोस्टिमुलेशन / कोरप्रेशन, और सिग्नल चार के रूप में संदर्भित प्रभावकारी कणों की परिणामी रिहाई।
यह पेपर मॉडल एपीसी की सतह संरचना की नकल करने के लिए बीएसएलबी का उपयोग करते समय विचार करने के लिए प्रोटोकॉल और महत्वपूर्ण तकनीकी बिंदुओं का वर्णन करता है। एपीसी पर प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स और अन्य सतह प्रोटीन के मात्रात्मक माप के लिए प्रोटोकॉल इन मापा मात्राओं वाले सिंथेटिक एपीसी के पुनर्गठन के लिए प्रोटोकॉल के साथ प्रस्तुत किए जाते हैं। फिर, टी कोशिकाओं और बीएसएलबी को सह-संवर्धित करने के लिए आवश्यक चरणों को प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके ट्रांस-सिनैप्टिक कण हस्तांतरण के मात्रात्मक माप के लिए प्रोटोकॉल के साथ प्रस्तुत किया जाता है। सबसे उल्लेखनीय रूप से, बीएसएलबी टीएसवी की प्लाज्मा झिल्ली-व्युत्पन्न आबादी का अध्ययन करने की सुविधा प्रदान करते हैं, जिसे सिनैप्टिक एक्टोसोम (एसई) कहा जाता है। टी-सेल एंटीजन रिसेप्टर-समृद्ध (टीसीआर +) एसई को टीसीआर ट्रिगरिंग 2 के जवाब में बहाया जाता है और कुशलतापूर्वक बीएसएलबी 3 द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, जो एंटीजन के एगोनिस्टिक गुणों और मॉडलकिए गए झिल्ली संरचना का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट रीडआउट का प्रतिनिधित्व करता है। CD63+ एक्सोसोम और सुपरमोलेक्यूलर अटैक पार्टिकल्स (SMAPs) भी उत्तेजित टी कोशिकाओं द्वारा जारी किए जाते हैं और BSLBs द्वारा कब्जा कर लिया जाता है। उन्हें सक्रियण के अतिरिक्त रीडआउट और टी कोशिकाओं द्वारा परिणामी एक्सोसाइटिक और लाइटिक ग्रेन्युल स्राव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। टी सेल के इंटरैक्टिंग पोल के लिए एक्सोसाइटिक पुटिकाओं की लामबंदी भी साइटोकिन्स की दिशात्मक रिहाई की सुविधा प्रदान करती है, जैसे आईएल -2, आईएफएन -γ, और आईएल -10 सक्रियण 4,5,6,7,8 के जवाब में। यद्यपि टी-सेल जारी साइटोकिन्स को बीएसएलबी पर भी पता लगाया जा सकता है, वर्तमान में इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स में साइटोकाइन रिलीज के मात्रात्मक विश्लेषण को मान्य करने के लिए एक अधिक समर्पित अध्ययन विकास के अधीन है।
यह पूछने के लिए कि विशिष्ट झिल्ली रचनाएं टी कोशिकाओं के सिनैप्टिक आउटपुट को कैसे प्रभावित करती हैं, इसके लिए लक्ष्य झिल्ली घटक के शारीरिक घनत्व को परिभाषित करने की आवश्यकता होती है। सेल सतह प्रोटीन के फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परिमाणीकरण इस प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम हैं और इसकी आवश्यकता होती है: 1) प्रति एंटीबॉडी (एफ / पी) फ्लोरोक्रोम की ज्ञात संख्या के साथ एंटीबॉडी का उपयोग, और 2) बेंचमार्क मोती मापा माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) से फ्लोरोक्रोम अणुओं को इंटरपोल करने के लिए एक मानक संदर्भ प्रदान करते हैं।
इन बेंचमार्क मानकों में पांच मनका आबादी होती है, जिनमें से प्रत्येक में समतुल्य घुलनशील फ्लोरोक्रोम (एमईएसएफ) की बढ़ती संख्या होती है, जो मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति का पता लगाने की गतिशील सीमा को फैलाती है। ये मानक आबादी असतत प्रतिदीप्ति चोटियों की उपज, सरल रैखिक प्रतिगमन द्वारा एमईएसएफ में मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूपांतरण की सुविधा प्रदान करती है। परिणामी एमईएसएफ का उपयोग तब एंटीबॉडी एफ / पी मानों के साथ प्रति सेल बाउंड अणुओं की औसत संख्या की गणना करने के लिए किया जाता है (या बाद के चरणों में बीएसएलबी)। पता लगाए गए अणुओं की औसत संख्या के लिए अनुमानित सेल सतह क्षेत्रों का अनुप्रयोग तब अणुओं / μm2 के रूप में शारीरिक घनत्व की गणना को सक्षम बनाता है। इस परिमाणीकरण प्रोटोकॉल को टी कोशिकाओं पर प्रोटीन घनत्व के माप और झिल्ली रचनाओं के जैव रासायनिक पुनर्गठन के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है जो होमोटाइपिक टी सेल सिनेप्स (यानी, टी-टी synapses9) के गठन की मध्यस्थता करता है। यदि आवश्यक हो, तो प्रति अणु फ्लोरोक्रोम की ज्ञात संख्या के साथ लेबल किए गए पुनः संयोजक लक्ष्यों का उपयोग करके एंटीबॉडी बाइंडिंग की संयोजकता का अनुमान लगाया जा सकता है। फिर, एंटीबॉडी-बाइंडिंग वैलेंसी की गणना एक ही बीएसएलबी आबादी के लिए एक ही समय में बाध्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन और परिमाणीकरण एंटीबॉडी (दो अलग-अलग परिमाणीकरण फ्लोरोक्रोम और एमईएसएफ मानकों का उपयोग करके) की संख्या की तुलना करके की जा सकती है।
एपीसी झिल्ली के पुनर्गठन के लिए सिलिका मोतियों 1 पर समर्थित लिपिड बाईलेयर (एसएलबी) की असेंबली की आवश्यकता होती है। विभिन्न फॉस्फोलिपिड प्रजातियों वाले लिपोसोम स्टॉक का उपयोग एक बहुमुखी लिपिड-बाईलेयर मैट्रिक्स बनाने के लिए किया जा सकता है, जो विभिन्न बाध्यकारी रसायन विज्ञान के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन की एंकरिंग को सक्षम करता है (लिपोसोम की तैयारी 10 में विस्तृत है)। एक बार जब प्रासंगिक लिगैंड “कोशिकाओं पर” के शारीरिक घनत्व (या घनत्व) को परिभाषित किया जाता है, तो एक ही प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल को लक्ष्य शारीरिक घनत्व के साथ बीएसएलबी को कोट करने के लिए आवश्यक पुनः संयोजक प्रोटीन की एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए अनुकूलित किया जाता है। दो अलग-अलग एंकरिंग सिस्टम का उपयोग या तो संयोजन में या अलग-अलग किया जा सकता है।
सबसे पहले, एसएलबी जिसमें Ni2 + का अंतिम 12.5 mol% होता है – फॉस्फोलिपिड्स युक्त लगभग 10,000 हिज़-टैग बाइंडिंग साइटों को प्रति वर्ग माइक्रोन 10 प्रदान करने के लिए पर्याप्त है और सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन के साथ BSLBs को सजाने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, जिसका शारीरिक घनत्व इस अधिकतम लोडिंग क्षमता से अधिक नहीं है। दूसरी लोडिंग प्रणाली बायोटिन युक्त फॉस्फोलिपिड्स (मोल के रूप में) का उपयोग करती है ताकि स्ट्रेप्टाविडिन पुलों के माध्यम से बायोटिनिलेटेड एंटी-सीडी 3 ई फैब (या एचएलए / एमएचसी मोनोमर्स) को लोड किया जा सके। इन दो बीएसएलबी सजावट विधियों का संयोजन तब सिंथेटिक एपीसी के रूप में बीएसएलबी की लचीली सिलाई को सक्षम बनाता है। अत्यधिक जटिल एपीसी सतह रचनाओं के लिए, फॉस्फोलिपिड्स और प्रोटीन के मोल% को हाथ में प्रश्न के रूप में कई प्रोटीन लोड करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। एक बार प्रोटीन की कार्यशील सांद्रता और बायोटिनिलेटेड फॉस्फोलिपिड्स के मोल% को परिभाषित करने के बाद, बीएसएलबी को मल्टीपैरामीट्रिक प्रवाह साइटोमेट्री के साथ टी कोशिकाओं के सिनैप्टिक आउटपुट से पूछताछ करने के लिए इकट्ठा किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
BSLBs मॉडल APC झिल्ली के साथ प्रेरित टी कोशिकाओं के कण आउटपुट का अध्ययन करने के लिए बहुमुखी उपकरण हैं। विधि का लचीलापन जटिल और न्यूनीकरणवादी झिल्ली रचनाओं के पुनर्गठन को टीएसवी और सुपरमोलेक्यूलर हमले के क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रचनात्मक वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए हमारे प्रयोगशाला के सदस्यों और रुमेटोलॉजी समुदाय के कैनेडी इंस्टीट्यूट के आभारी हैं, विशेष रूप से हमारे प्रवाह साइटोमेट्री सुविधा प्रबंधक जोनाथन वेबर। इस काम को वेलकम ट्रस्ट प्रिंसिपल रिसर्च फेलोशिप 100262Z / 12 / Z, ERC उन्नत अनुदान (SYNECT AdG 670930), और रुमेटोलॉजी रिसर्च (KTRR) के लिए कैनेडी ट्रस्ट (सभी तीन एमएलडी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। PFCD EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (ALTF 1420-2015, यूरोपीय आयोग (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) और मैरी Sklodowska-Curie Actions) और एक ऑक्सफोर्ड-ब्रिस्टल मायर्स स्क्विब फैलोशिप के साथ संयोजन के रूप में समर्थित था।
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
Riferimenti
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