Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen
Summary
Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.
Abstract
Antigeen-presenterende cellen (APC’s) presenteren drie activerende signalen aan T-cellen die betrokken zijn bij fysiek contact: 1) antigeen, 2) costimulatie / corepressie en 3) oplosbare cytokines. T-cellen geven twee soorten effectordeeltjes af als reactie op activering: trans-synaptische blaasjes (tSV’s) en supramoleculaire aanvalsdeeltjes, die respectievelijk intercellulaire boodschappers overbrengen en cytotoxiciteit bemiddelen. Deze entiteiten worden snel geïnternaliseerd door APC’s die fysiek contact hebben met T-cellen, waardoor hun karakterisering ontmoedigend is. Dit artikel presenteert het protocol om Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) te fabriceren en te gebruiken als antigeen-presenterende cel (APC) mimetica om deze trans-synaptische deeltjes te vangen en te analyseren. Ook worden de protocollen beschreven voor de absolute metingen van eiwitdichtheden op celoppervlakken, de reconstitutie van BSLBs met dergelijke fysiologische niveaus en de flowcytometrieprocedure voor het volgen van de afgifte van synaptische deeltjes door T-cellen. Dit protocol kan worden aangepast om de effecten van individuele eiwitten, complexe ligandmengsels, pathogene virulentiedeterminanten en geneesmiddelen op de effectoroutput van T-cellen te bestuderen, waaronder helper T-cellen, cytotoxische T-lymfocyten, regulerende T-cellen en chimere antigeenreceptor-expresserende T-cellen (CART).
Introduction
De immunologische synaps (IS) is een cruciale moleculaire structuur gevormd op het grensvlak van cellen die betrokken zijn bij fysiek contact dat de gereguleerde uitwisseling van juxtracrine-informatie vergemakkelijkt. Verschillende ES’en zijn beschreven in de literatuur, en een groeiend aantal bewijzen suggereert dat deze moleculaire hubs een geconserveerd kenmerk zijn van cellulaire netwerken. Verschillende immuuncellen, waaronder B-cellen, natural killer-cellen, dendritische cellen, macrofagen en T-cellen, wisselen informatie uit via de assemblage van kortstondige contacten1. Multiomische studies bevorderen het begrip van nieuwe subsets van leukocyten en stromale cellen die pathogene cellulaire netwerken aandrijven en oppervlakte-eiwitten met onbekende functies tot expressie brengen. Als synthetische APC’s maken BSLBs het mogelijk om direct onderzoek te doen naar de functionele rol van individuele eiwitten bij de integratie van activerende signalen, namelijk antigenen en costimulatie/corepressie, door T-cellen en de resulterende afgifte van effectordeeltjes die signaal vier worden genoemd.
Dit artikel beschrijft de protocollen en kritieke technische punten waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van BSLBs om de oppervlaktesamenstelling van model-APC’s na te bootsen. De protocollen voor de kwantitatieve meting van immuunreceptoren en andere oppervlakte-eiwitten op APC’s worden gepresenteerd samen met het protocol voor de reconstitutie van synthetische APC’s die deze gemeten hoeveelheden bevatten. Vervolgens worden de stappen die nodig zijn voor het cocultureren van T-cellen en BSLB gepresenteerd, samen met het protocol voor de kwantitatieve meting van trans-synaptische deeltjesoverdracht met behulp van flowcytometrie. Het meest opmerkelijke is dat BSLBs het bestuderen van een plasmamembraan-afgeleide populatie van tSV’s genaamd synaptische ectosomen (SE’s) vergemakkelijken. T-cel antigeenreceptorverrijkte (TCR+) SE’s worden afgestoten als reactie op TCR-triggering2 en efficiënt opgevangen door BSLBs3, wat een uitstekende uitlezing vertegenwoordigt om de agonistische eigenschappen van antigenen en de gemodelleerde membraansamenstelling te beoordelen. CD63+ exosomen en supramoleculaire aanvalsdeeltjes (SMAPs) worden ook vrijgegeven door gestimuleerde T-cellen en opgevangen door BSLBs. Ze kunnen worden gebruikt als extra uitlezingen van activering en de resulterende exocytische en lytische korrelsecretie door T-cellen. De mobilisatie van exocytische blaasjes naar de interagerende pool van de T-cel vergemakkelijkt ook de directionele afgifte van cytokines, zoals IL-2, IFN-γ en IL-10 als reactie op activering4,5,6,7,8. Hoewel T-cel vrijgegeven cytokines ook kunnen worden gedetecteerd op BSLBs, is er momenteel een meer toegewijde studie in ontwikkeling om de kwantitatieve analyse van cytokine-afgifte bij de immunologische synaps te valideren.
Om te onderzoeken hoe specifieke membraansamenstellingen de synaptische output van T-cellen beïnvloeden, moet de fysiologische dichtheid van de doelmembraancomponent worden gedefinieerd. Op flowcytometrie gebaseerde kwantificeringen van celoppervlakeiwitten zijn een essentiële stap in dit protocol en vereisen: 1) het gebruik van antilichamen met bekende aantallen fluorochchromen per antilichaam (F / P), en 2) benchmarkparels die een standaardreferentie bieden voor het interpoleren van fluorochroommoleculen uit gemeten gemiddelde fluorescentie-intensiteiten (MFI’s).
Deze benchmarkstandaarden bestaan uit vijf kralenpopulaties, die elk een toenemend aantal equivalent oplosbare fluorochchromen (MESF’s) bevatten, die het dynamische bereik van willekeurige fluorescentiedetectie overspannen. Deze standaardpopulaties leveren discrete fluorescentiepieken op, waardoor de omzetting van willekeurige fluorescentie-eenheden in MESF’s door eenvoudige lineaire regressie wordt vergemakkelijkt. De resulterende MESF’s worden vervolgens gebruikt naast antilichaam F / P-waarden om het gemiddelde aantal gebonden moleculen per cel (of BSLB in latere stappen) te berekenen. De toepassing van geschatte celoppervlakken op het gemiddelde aantal gedetecteerde moleculen maakt vervolgens de berekening van fysiologische dichtheden als moleculen/μm2 mogelijk. Dit kwantificeringsprotocol kan ook worden aangepast aan de meting van eiwitdichtheden op T-cellen en de biochemische reconstitutie van membraansamenstellingen die de vorming van homotypische T-cel synapsen (d.w.z. T-T-synapsen9) bemiddelen. Indien nodig kan de valentie van antilichaambinding verder worden geschat door recombinante doelen te gebruiken die zijn gelabeld met bekende aantallen fluorochromen per molecuul. Vervolgens kan de antilichaambindende valentie voor dezelfde BSLB-populatie worden berekend door tegelijkertijd het aantal gebonden fluorescerende eiwitten en kwantificeringsantistoffen te vergelijken (met behulp van twee verschillende kwantificeringsfluorocchromen en MESF-normen).
De reconstitutie van APC-membranen vereist de assemblage van ondersteunde lipide bilayers (SLBs) op silicakorrels1. Liposoomvoorraden die verschillende fosfolipidesoorten bevatten, kunnen worden gebruikt om een veelzijdige lipide-dubbellaagsmatrix te vormen, waardoor recombinante eiwitten met verschillende bindingschemie kunnen worden verankerd (de bereiding van liposomen wordt beschreven in 10). Zodra de fysiologische dichtheid (of dichtheden) van het relevante ligand “op cellen” is gedefinieerd, wordt hetzelfde flowcytometrieprotocol aangepast om de concentratie van recombinant eiwit te schatten die nodig is om BSLBs te coaten met de beoogde fysiologische dichtheid. Twee verschillende verankeringssystemen kunnen in combinatie of afzonderlijk worden gebruikt.
Ten eerste is SLB met een laatste 12,5 mol% Ni2+-bevattende fosfolipiden voldoende om ongeveer 10.000 His-tag bindingsplaatsen per vierkante micron10 te leveren en werkt het goed om BSLBs te versieren met de meeste in de handel verkrijgbare eiwitten waarvan de fysiologische dichtheden deze maximale laadcapaciteit niet overschrijden. Het tweede laadsysteem maakt gebruik van biotinebevattende fosfolipiden (als mol%) om gebiotinyleerde anti-CD3e Fab (of HLA/MHC-monomeren) te laden via streptavidinbruggen. De combinatie van deze twee BSLB-decoratiemethoden maakt vervolgens de flexibele afstemming van BSLBs als synthetische APC’s mogelijk. Voor zeer complexe APC-oppervlaktesamenstellingen kan de mol% van fosfolipiden en eiwitten worden verhoogd om zoveel eiwitten te laden als de vraag vereist. Zodra de werkconcentraties van eiwitten en mol% van gebiotinyleerde fosfolipiden zijn gedefinieerd, kunnen BSLBs worden geassembleerd om de synaptische output van T-cellen te ondervragen met multiparametrische flowcytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
BSLBs zijn veelzijdige hulpmiddelen voor het bestuderen van de deeltjesoutput van T-cellen gestimuleerd met model APC-membranen. De flexibiliteit van de methode maakt de reconstitutie van complexe en reductionistische membraansamenstellingen mogelijk om de effecten van liganden en hun signalen op de secretie van tSV’s en supramoleculaire aanvalsdeeltjes en hun componenten te bestuderen. We hebben deze technologie getest op verschillende T-cellen, waaronder gepreactiveerde TH, CTL, Tregs en CART15….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn onze laboratoriumleden en de Kennedy Institute of Rheumatology-gemeenschap dankbaar voor constructieve wetenschappelijke discussies, met name onze flowcytometrie facility manager Jonathan Webber. Dit werk werd gefinancierd door Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, de ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) en de Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle drie tot MLD). PFCD werd ondersteund door EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in samenwerking met de Europese Commissie (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) en Marie Sklodowska-Curie Actions) en een Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
Riferimenti
- Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
- Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
- Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
- Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
- Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
- Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
- Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021)
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
- Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
- Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
- Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
- Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
- Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
- Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).
