Modelage de micro-organismes et de microparticules par assemblage séquentiel assisté par capillarité
Summary
Nous présentons une technologie qui utilise l’assemblage assisté par capillarité dans une plate-forme microfluidique pour modeler des objets de taille micro en suspension dans un liquide, tels que des bactéries et des colloïdes, dans des réseaux prescrits sur un substrat de polydiméthylsiloxane.
Abstract
La modelage contrôlé des micro-organismes dans des arrangements spatiaux définis offre des possibilités uniques pour un large éventail d’applications biologiques, y compris des études de la physiologie microbienne et des interactions. Au niveau le plus simple, une modélisation spatiale précise des micro-organismes permettrait une imagerie fiable et à long terme d’un grand nombre de cellules individuelles et transformerait la capacité d’étudier quantitativement les interactions microbe-microbe dépendantes de la distance. De manière plus unique, le couplage d’une modélisation spatiale précise et d’un contrôle total des conditions environnementales, tel qu’offert par la technologie microfluidique, fournirait une plate-forme puissante et polyvalente pour les études unicellulaires en écologie microbienne.
Cet article présente une plate-forme microfluidique pour produire des modèles polyvalents et définis par l’utilisateur de micro-organismes dans un canal microfluidique, permettant un accès optique complet pour une surveillance à long terme et à haut débit. Cette nouvelle technologie microfluidique est basée sur l’assemblage de particules assisté par capillarité et exploite les forces capillaires résultant du mouvement contrôlé d’une suspension d’évaporation à l’intérieur d’un canal microfluidique pour déposer des objets microdimensionnels individuels dans un réseau de pièges microfabriqués sur un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS). Les dépôts séquentiels génèrent la disposition spatiale souhaitée d’un ou de plusieurs types d’objets de micro-taille, dictée uniquement par la géométrie des pièges et la séquence de remplissage.
La plate-forme a été calibrée à l’aide de particules colloïdales de différentes dimensions et matériaux: elle s’est avérée être un outil puissant pour générer divers motifs colloïdaux et effectuer la fonctionnalisation de surface des particules piégées. En outre, la plate-forme a été testée sur des cellules microbiennes, en utilisant des cellules d’Escherichia coli comme bactérie modèle. Des milliers de cellules individuelles ont été modelées à la surface et leur croissance a été surveillée au fil du temps. Dans cette plate-forme, le couplage du dépôt unicellulaire et de la technologie microfluidique permet à la fois la modélisation géométrique des micro-organismes et le contrôle précis des conditions environnementales. Il ouvre ainsi une fenêtre sur la physiologie des microbes isolés et l’écologie des interactions microbe-microbe, comme le montrent des expériences préliminaires.
Introduction
La modélisation spatiale de micro-organismes uniques, en particulier dans les arènes expérimentales qui permettent un contrôle total des conditions environnementales, telles que les dispositifs microfluidiques, est hautement souhaitable dans un large éventail de contextes. Par exemple, organiser les micro-organismes en réseaux réguliers permettrait l’imagerie précise d’un grand nombre de cellules individuelles et l’étude de leur croissance, de leur physiologie, de leur expression génique en réponse à des stimuli environnementaux et de leur susceptibilité aux médicaments. Il permettrait également d’étudier les interactions cellule-cellule présentant un intérêt particulier dans la recherche sur la communication cellulaire (p. ex., la détection du quorum), l’alimentation croisée (p. ex., symbiose algale-bactérienne) ou l’antagonisme (p. ex., l’allélopathie), avec un contrôle total sur la localisation spatiale des cellules les unes par rapport aux autres. Les études de physiologie et d’évolution cellulaire1, les études d’interaction cellule-cellule2, le dépistage de la différenciation phénotypique3, la surveillance de l’environnement4 et le dépistage des médicaments5 font partie des domaines qui peuvent grandement bénéficier d’une technologie capable de réaliser une telle analyse quantitative unicellulaire.
Plusieurs stratégies pour isoler et manipuler des cellules individuelles ont été proposées au cours des dernières années, allant des pièges optiques holographiques6 et des méthodes de fonctionnalisation de surface hétérogène7,8,9,10 aux chimiostats unicellulaires11 et à la microfluidique des gouttelettes12. Ces méthodes sont soit techniquement très exigeantes, soit affectent la physiologie cellulaire et ne parviennent pas à fournir une plate-forme à haut débit pour modéliser des microbes qui peuvent être étudiés sur de longues périodes, assurant une résolution d’une seule cellule, un accès optique complet et un contrôle des conditions environnementales. L’objectif de cet article est de décrire une plate-forme permettant de modeler les bactéries avec une précision micrométrique dans des arrangements spatiaux prescrits sur une surface PDMS grâce à un assemblage assisté par capillarité. Cette plate-forme permet une modélisation spatiale précise et flexible des microbes et permet un accès optique complet et un contrôle des conditions environnementales, grâce à sa nature microfluidique.
La technologie derrière cette plate-forme est une technologie d’assemblage développée ces dernières années, nommée sCAPA13,14,15 (assemblage séquentiel de particules assistées par capillarité) qui a été intégrée dans une plate-forme microfluidique16. Le ménisque d’une gouttelette liquide en évaporation, tout en reculant sur un substrat de polydiméthylsiloxane à motifs (PDMS) à l’intérieur d’un canal microfluidique, exerce des forces capillaires qui piègent les particules colloïdales individuelles en suspension dans le liquide dans des puits micrométriques microfabriqués sur le substrat (Figure 1A). Les particules en suspension sont d’abord transportées vers l’interface air-liquide par des courants convectifs, puis placées dans les pièges par capillarité. Les forces capillaires exercées par le ménisque en mouvement agissent à plus grande échelle par rapport aux forces impliquées dans les interactions des particules.
Ainsi, le mécanisme d’assemblage n’est pas influencé par le matériau, les dimensions et les propriétés de surface des particules. Des paramètres tels que la concentration en particules, la vitesse du ménisque, la température et la tension superficielle de la suspension sont les seuls paramètres qui influencent le rendement du processus de modelage. Le lecteur peut trouver une description détaillée de l’influence des paramètres susmentionnés sur le processus de modelage dans 13,14,15. Dans la technologie sCAPA d’origine13,14,15, le processus de modelage colloïdal était effectué dans un système ouvert et nécessitait un étage piézoélectrique de haute précision pour entraîner la suspension à travers le gabarit. Cette plateforme exploite une stratégie différente et permet d’effectuer le modelage avec des équipements standards généralement utilisés en microfluidique dans un environnement contrôlé, minimisant ainsi les risques de contamination des échantillons.
Cette plate-forme microfluidique a d’abord été optimisée sur des particules colloïdales pour créer des réseaux réguliers de particules inertes, puis appliquée avec succès aux bactéries. Les deux plateformes microfluidiques sont décrites dans cet article (Figure 1B,C). La plupart des étapes préparatoires et de l’équipement expérimental décrits dans le protocole sont communs pour les deux applications (Figure 2). Nous rapportons des motifs colloïdaux pour démontrer que la technique peut être utilisée pour effectuer plusieurs dépôts séquentiels sur la même surface afin de créer des motifs complexes et multimatériaux. En particulier, une seule particule a été déposée par piège pour chaque étape afin de former des réseaux colloïdaux avec une géométrie et une composition spécifiques, uniquement dictées par la géométrie et la séquence de remplissage des pièges. En ce qui concerne les motifs bactériens, des dépôts uniques sont décrits, ce qui entraîne le dépôt d’une bactérie par piège. Une fois que les cellules sont modelées à la surface, le canal microfluidique est rincé avec un milieu pour favoriser la croissance bactérienne, l’étape préliminaire de toute étude unicellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plate-forme microfluidique décrite ici permet de modeler des objets de taille micro, tels que des colloïdes et des bactéries, dans des arrangements spatiaux prescrits sur un substrat PDMS. Le contrôle total des conditions environnementales offertes par la microfluidique et la capacité de modeler les cellules avec une précision micrométrique accordée par la technologie sCAPA en font une plate-forme très prometteuse pour les futures études de physiologie et d’écologie.
Dans les e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien de la subvention PRIMA du FNS 179834 (à E.S.), d’une subvention de recherche de l’ETH ETH-15 17-1 (R. S.) et d’une bourse de chercheur de la Fondation Gordon et Betty Moore sur la symbiose microbienne aquatique (subvention GBMF9197) (R. S.). Les auteurs remercient le Dr Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Université de Grenade, Espagne) pour l’imagerie SEM des bactéries et pour les discussions perspicaces. Les auteurs remercient le Dr Jen Nguyen (Université de la Colombie-Britannique, Canada), la Dre Laura Alvarez (ETH Zürich, Suisse), Cameron Boggon (ETH Zürich, Suisse) et le Dr Fabio Grillo pour leurs discussions perspicaces.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
Riferimenti
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
