Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage
Summary
Wir stellen eine Technologie vor, die kapillaritätsunterstützte Montage in einer mikrofluidischen Plattform verwendet, um in einer Flüssigkeit suspendierte Objekte in Mikrogröße, wie Bakterien und Kolloide, in vorgeschriebene Arrays auf einem Polydimethylsiloxansubstrat zu strukturieren.
Abstract
Die kontrollierte Strukturierung von Mikroorganismen in definierte räumliche Anordnungen bietet einzigartige Möglichkeiten für ein breites Spektrum biologischer Anwendungen, einschließlich Studien der mikrobiellen Physiologie und Interaktionen. Auf der einfachsten Ebene würde eine genaue räumliche Strukturierung von Mikroorganismen eine zuverlässige, langfristige Bildgebung einer großen Anzahl einzelner Zellen ermöglichen und die Fähigkeit zur quantitativen Untersuchung von entfernungsabhängigen Mikroben-Mikroben-Interaktionen verändern. Noch einzigartiger ist, dass die Kopplung genauer räumlicher Musterung und voller Kontrolle über Umweltbedingungen, wie sie die mikrofluidische Technologie bietet, eine leistungsstarke und vielseitige Plattform für Einzelzellstudien in der mikrobiellen Ökologie bieten würde.
Dieser Beitrag stellt eine mikrofluidische Plattform vor, um vielseitige und benutzerdefinierte Muster von Mikroorganismen innerhalb eines mikrofluidischen Kanals zu erzeugen, die einen vollständigen optischen Zugriff für eine langfristige Überwachung mit hohem Durchsatz ermöglichen. Diese neue mikrofluidische Technologie basiert auf einer kapillaritätsunterstützten Partikelanordnung und nutzt die Kapillarkräfte, die sich aus der kontrollierten Bewegung einer verdampfenden Suspension in einem mikrofluidischen Kanal ergeben, um einzelne mikroskalierte Objekte in einer Reihe von Fallen abzuscheiden, die mikrofabriziert auf einem Polydimethylsiloxan (PDMS) -Substrat liegen. Sequenzielle Ablagerungen erzeugen das gewünschte räumliche Layout einzelner oder mehrerer Arten von Objekten in Mikrogröße, die ausschließlich durch die Geometrie der Fallen und die Füllreihenfolge bestimmt werden.
Die Plattform wurde mit kolloidalen Partikeln unterschiedlicher Größe und Materialien kalibriert: Sie hat sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um verschiedene kolloidale Muster zu erzeugen und eine Oberflächenfunktionalisierung von eingeschlossenen Partikeln durchzuführen. Darüber hinaus wurde die Plattform an mikrobiellen Zellen getestet, wobei Escherichia coli-Zellen als Modellbakterium verwendet wurden. Tausende von einzelnen Zellen waren auf der Oberfläche strukturiert und ihr Wachstum wurde im Laufe der Zeit überwacht. In dieser Plattform ermöglicht die Kopplung von Einzelzellabscheidung und mikrofluidischer Technologie sowohl die geometrische Strukturierung von Mikroorganismen als auch die präzise Kontrolle der Umgebungsbedingungen. Es öffnet sich damit ein Fenster in die Physiologie einzelner Mikroben und die Ökologie von Mikroben-Mikroben-Interaktionen, wie vorexperimentelle Experimente gezeigt haben.
Introduction
Die räumliche Strukturierung einzelner Mikroorganismen, insbesondere in experimentellen Arenen, die die volle Kontrolle über Umweltbedingungen ermöglichen, wie z. B. mikrofluidische Geräte, ist in einer Vielzahl von Kontexten sehr wünschenswert. Zum Beispiel würde die Anordnung von Mikroorganismen in regulären Arrays die genaue Abbildung einer großen Anzahl einzelner Zellen und die Untersuchung ihres Wachstums, ihrer Physiologie, ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und ihrer Arzneimittelempfindlichkeit ermöglichen. Es würde auch die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen von besonderem Interesse für die Erforschung der zellulären Kommunikation (z. B. Quorum-Sensing), der Kreuzfütterung (z. B. Algen-Bakterien-Symbiose) oder des Antagonismus (z. B. Allelopathie) mit voller Kontrolle über die räumliche Lokalisierung von Zellen relativ zueinander ermöglichen. Zellphysiologische und Evolutionsstudien1, Zell-Zell-Interaktionsstudien2, phänotypisches Differenzierungsscreening3, Umweltmonitoring4 und Arzneimittelscreening5 gehören zu den Bereichen, die von einer Technologie, die in der Lage ist, eine solche quantitative Einzelzellanalyse zu erreichen, stark profitieren können.
In den letzten Jahren wurden mehrere Strategien zur Isolierung und Handhabung einzelner Zellen vorgeschlagen, von holographischen optischen Fallen6 und heterogenen Oberflächenfunktionalisierungsmethoden7,8,9,10 bis hin zu einzelligen Chemostaten11 und Tröpfchenmikrofluidik12. Diese Methoden sind entweder technisch sehr anspruchsvoll oder beeinflussen die Zellphysiologie und bieten keine Hochdurchsatzplattform, um Mikroben zu mustern, die über lange Zeiträume untersucht werden können, um eine Einzelzellauflösung, einen vollständigen optischen Zugang und die Kontrolle über Die Umgebungsbedingungen zu gewährleisten. Das Ziel dieses Papiers ist es, eine Plattform zu beschreiben, um Bakterien mit mikrometrischer Präzision in vorgeschriebene räumliche Anordnungen auf einer PDMS-Oberfläche durch kapillaritätsunterstützte Montage zu strukturieren. Diese Plattform ermöglicht eine präzise und flexible räumliche Strukturierung von Mikroben und ermöglicht dank ihrer mikrofluidischen Natur den vollständigen optischen Zugang und die Kontrolle über Die Umgebungsbedingungen.
Die Technologie hinter dieser Plattform ist eine in den letzten Jahren entwickelte Montagetechnologie namens sCAPA13,14,15 (sequential capillarity-assisted particle assembly), die in eine mikrofluidische Plattform16 integriert wurde. Der Meniskus eines verdampfenden Flüssigkeitströpfchens, während er sich über ein gemustertes Polydimethylsiloxan (PDMS) -Substrat in einem mikrofluidischen Kanal zurückzieht, übt Kapillarkräfte aus, die die einzelnen in der Flüssigkeit suspendierten kolloidalen Partikel in mikrometrischen Vertiefungen einfangen, die auf dem Substrat mikrofabriziert sind (Abbildung 1A). Schwebstoffe werden zunächst durch konvektive Ströme an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche transportiert und dann kapillar in die Fallen gelegt. Kapillarkräfte, die vom sich bewegenden Meniskus ausgeübt werden, wirken im Vergleich zu Kräften, die an Teilchenwechselwirkungen beteiligt sind, in größerem Maßstab.
Somit wird der Montagemechanismus nicht durch das Material, die Abmessungen und die Oberflächeneigenschaften der Partikel beeinflusst. Parameter wie Partikelkonzentration, Die Geschwindigkeit des Meniskus, Temperatur und Oberflächenspannung der Suspension sind die einzigen Parameter, die die Ausbeute des Strukturierungsprozesses beeinflussen. Eine detaillierte Beschreibung des Einflusses der vorgenannten Parameter auf den Musterungsprozess findet der Leser in13,14,15. In der ursprünglichen sCAPA-Technologie13,14,15 wurde der kolloidale Strukturierungsprozess in einem offenen System durchgeführt und erforderte eine hochpräzise piezoelektrische Stufe, um die Aufhängung über die Schablone anzutreiben. Diese Plattform nutzt eine andere Strategie und ermöglicht es, die Musterung mit Standardgeräten durchzuführen, die üblicherweise in der Mikrofluidik in einer kontrollierten Umgebung verwendet werden, wodurch das Risiko einer Kontamination der Proben minimiert wird.
Diese mikrofluidische Plattform wurde zunächst auf kolloidale Partikel optimiert, um regelmäßige Arrays inerter Partikel zu erzeugen, und dann erfolgreich auf Bakterien angewendet. Beide mikrofluidischen Plattformen werden in diesem Paper beschrieben (Abbildung 1B,C). Die meisten vorbereitenden Schritte und die im Protokoll beschriebene Versuchsausrüstung sind für die beiden Anwendungen üblich (Abbildung 2). Wir berichten über kolloidale Muster, um zu zeigen, dass die Technik verwendet werden kann, um mehrere sequentielle Abscheidungen auf derselben Oberfläche durchzuführen, um komplexe, multimaterialartige Muster zu erzeugen. Insbesondere wurde pro Trap für jeden Schritt ein einzelnes Partikel abgeschieden, um kolloidale Arrays mit einer spezifischen Geometrie und Zusammensetzung zu bilden, die ausschließlich von der Geometrie und der Füllreihenfolge der Traps bestimmt wurden. Was die bakterielle Musterung betrifft, so werden einzelne Ablagerungen beschrieben, was dazu führt, dass sich pro Falle ein Bakterium ablagert. Sobald die Zellen auf der Oberfläche strukturiert sind, wird der mikrofluidische Kanal mit Medium gespült, um das Bakterienwachstum zu fördern, der erste Schritt jeder Einzelzellstudie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene mikrofluidische Plattform ermöglicht die Strukturierung von mikrogroßen Objekten wie Kolloiden und Bakterien in vorgeschriebene räumliche Anordnungen auf einem PDMS-Substrat. Die volle Kontrolle über die Umweltbedingungen, die die Mikrofluidik bietet, und die Fähigkeit, Zellen mit mikrometrischer Präzision zu strukturieren, die durch die sCAPA-Technologie gewährleistet wird, machen es zu einer vielversprechenden Plattform für zukünftige physiologische und ökologische Studien.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die Unterstützung durch den SNF PRIMA Grant 179834 (an E.S.), einen ETH Research Grant ETH-15 17-1 (R. S.) und einen Gordon and Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (Grant GBMF9197) (R. S.). Die Autoren danken Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Universität Granada, Spanien) für die SEM-Bildgebung von Bakterien und für die aufschlussreichen Diskussionen. Die Autoren danken Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Kanada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Schweiz), Cameron Boggon (ETH Zürich, Schweiz) und Dr. Fabio Grillo für die aufschlussreichen Diskussionen.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
Riferimenti
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