अनुक्रमिक केशिकाओं-सहायता प्राप्त असेंबली के माध्यम से सूक्ष्मजीवों और सूक्ष्म कणों का पैटर्निंग
Summary
हम एक ऐसी तकनीक पेश करते हैं जो एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म में केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली का उपयोग करती है ताकि एक तरल पदार्थ में निलंबित सूक्ष्म आकार की वस्तुओं को पैटर्न किया जा सके, जैसे कि बैक्टीरिया और कोलाइड्स, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन सब्सट्रेट पर निर्धारित सरणियों में।
Abstract
परिभाषित स्थानिक व्यवस्थाओं में सूक्ष्मजीवों का नियंत्रित पैटर्निंग जैविक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करता है, जिसमें माइक्रोबियल फिजियोलॉजी और इंटरैक्शन का अध्ययन शामिल है। सबसे सरल स्तर पर, सूक्ष्मजीवों की सटीक स्थानिक पैटर्निंग बड़ी संख्या में व्यक्तिगत कोशिकाओं की विश्वसनीय, दीर्घकालिक इमेजिंग को सक्षम करेगी और दूरी-निर्भर माइक्रोब-माइक्रोब इंटरैक्शन का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने की क्षमता को बदल देगी। अधिक विशिष्ट रूप से, सटीक स्थानिक पैटर्निंग और पर्यावरणीय परिस्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण का युग्मन, जैसा कि माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक द्वारा पेश किया गया है, माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में एकल-सेल अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी मंच प्रदान करेगा।
यह पेपर एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के भीतर सूक्ष्मजीवों के बहुमुखी और उपयोगकर्ता-परिभाषित पैटर्न का उत्पादन करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म प्रस्तुत करता है, जिससे दीर्घकालिक, उच्च-थ्रूपुट निगरानी के लिए पूर्ण ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति मिलती है। यह नई माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक केशिका-सहायता प्राप्त कण असेंबली पर आधारित है और एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर एक वाष्पीकरण निलंबन की नियंत्रित गति से उत्पन्न केशिका बलों का शोषण करती है ताकि व्यक्तिगत माइक्रोसाइज्ड वस्तुओं को एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट पर माइक्रोफैब्रिकेटेड ट्रैप की एक सरणी में जमा किया जा सके। अनुक्रमिक निक्षेपण एकल या कई प्रकार की सूक्ष्म आकार की वस्तुओं का वांछित स्थानिक लेआउट उत्पन्न करते हैं, जो पूरी तरह से जाल की ज्यामिति और भरने के अनुक्रम द्वारा निर्धारित होते हैं।
प्लेटफ़ॉर्म को विभिन्न आयामों और सामग्रियों के कोलाइडल कणों का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया है: यह विविध कोलाइडल पैटर्न उत्पन्न करने और फंसे हुए कणों की सतह कार्यात्मकता करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हुआ है। इसके अलावा, मंच का परीक्षण माइक्रोबियल कोशिकाओं पर किया गया था, एक मॉडल जीवाणु के रूप में एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं का उपयोग करके। हजारों व्यक्तिगत कोशिकाओं को सतह पर पैटर्न किया गया था, और समय के साथ उनके विकास की निगरानी की गई थी। इस मंच में, एकल-कोशिका जमाव और माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक का युग्मन सूक्ष्मजीवों के ज्यामितीय पैटर्निंग और पर्यावरणीय परिस्थितियों के सटीक नियंत्रण दोनों की अनुमति देता है। इस प्रकार यह एकल रोगाणुओं के शरीर विज्ञान और माइक्रोब-माइक्रोब इंटरैक्शन की पारिस्थितिकी में एक खिड़की खोलता है, जैसा कि प्रारंभिक प्रयोगों द्वारा दिखाया गया है।
Introduction
एकल सूक्ष्मजीवों का स्थानिक पैटर्निंग, विशेष रूप से प्रयोगात्मक क्षेत्रों के भीतर जो पर्यावरणीय स्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण को सक्षम करता है, जैसे कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण, संदर्भों की एक विस्तृत श्रृंखला में अत्यधिक वांछनीय है। उदाहरण के लिए, नियमित सरणियों में सूक्ष्मजीवों की व्यवस्था करने से बड़ी संख्या में व्यक्तिगत कोशिकाओं की सटीक इमेजिंग और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में उनके विकास, शरीर विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति और दवा संवेदनशीलता के अध्ययन की अनुमति मिलेगी। यह सेलुलर संचार (जैसे, कोरम सेंसिंग), क्रॉस-फीडिंग (जैसे, अल्गल-बैक्टीरियल सहजीवन), या विरोध (जैसे, एलेलोपैथी) में अनुसंधान में विशेष रुचि के सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने की भी अनुमति देगा, जिसमें एक-दूसरे के सापेक्ष कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण पर पूर्ण नियंत्रण होगा। सेल फिजियोलॉजी और विकास अध्ययन1, सेल-सेल इंटरैक्शन अध्ययन 2, फेनोटाइपिक भेदभाव स्क्रीनिंग 3, पर्यावरण निगरानी 4, और दवा स्क्रीनिंग 5 उन क्षेत्रों में से हैं जो इस तरह के मात्रात्मक एकल-सेल विश्लेषण को प्राप्त करने में सक्षम तकनीक से बहुत लाभ उठा सकते हैं।
एकल कोशिकाओं को अलग करने और संभालने के लिए कई रणनीतियों को हाल के वर्षों में प्रस्तावित किया गया है, होलोग्राफिक ऑप्टिकल ट्रैप 6 और विषम सतह कार्यात्मकता विधियों 7,8,9,10 से एकल-सेल केमोस्टैट्स 11 और ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स 12 तक। ये तरीके या तो तकनीकी रूप से बहुत मांग कर रहे हैं या सेल फिजियोलॉजी को प्रभावित करते हैं और पैटर्न रोगाणुओं के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफ़ॉर्म प्रदान करने में विफल रहते हैं जिनका लंबी अवधि में अध्ययन किया जा सकता है, एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन, पूर्ण ऑप्टिकल एक्सेस और पर्यावरणीय स्थितियों पर नियंत्रण सुनिश्चित करना। इस पेपर का लक्ष्य केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली के माध्यम से पीडीएमएस सतह पर निर्धारित स्थानिक व्यवस्था में माइक्रोमेट्रिक परिशुद्धता के साथ बैक्टीरिया को पैटर्न करने के लिए एक मंच का वर्णन करना है। यह प्लेटफ़ॉर्म रोगाणुओं के सटीक और लचीले स्थानिक पैटर्निंग की अनुमति देता है और पर्यावरणीय परिस्थितियों पर पूर्ण ऑप्टिकल पहुंच और नियंत्रण को सक्षम बनाता है, इसकी माइक्रोफ्लुइडिक प्रकृति के लिए धन्यवाद।
इस प्लेटफ़ॉर्म के पीछे की तकनीक हाल के वर्षों में विकसित एक असेंबली तकनीक है, जिसका नाम SCAPA13,14,15 (अनुक्रमिक केशिका-सहायता प्राप्त कण असेंबली) है जिसे माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म 16 में एकीकृत किया गया था। एक वाष्पीकरण तरल बूंद का मेनिस्कस, जबकि एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर एक पैटर्न वाले पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट पर कम हो रहा है, केशिका बलों को लागू करता है जो तरल में निलंबित व्यक्तिगत कोलाइडल कणों को माइक्रोमेट्रिक कुओं में फंसाते हैं जो सब्सट्रेट पर माइक्रोफैब्रिकेटेड माइक्रोफैब्रिकेटेड होते हैं (चित्रा 1 ए)। निलंबित कणों को पहले संवहनी धाराओं द्वारा हवा-तरल इंटरफ़ेस में ले जाया जाता है और फिर केशिकाओं द्वारा जाल में रखा जाता है। कण इंटरैक्शन में शामिल बलों की तुलना में चलती मेनिस्कस द्वारा लगाए गए केशिका बल बड़े पैमाने पर कार्य करते हैं।
इस प्रकार, असेंबली तंत्र कणों की सामग्री, आयामों और सतह गुणों से प्रभावित नहीं होता है। कण एकाग्रता, मेनिस्कस की गति, तापमान और निलंबन की सतह तनाव जैसे पैरामीटर एकमात्र पैरामीटर हैं जो पैटर्निंग प्रक्रिया की उपज को प्रभावित करते हैं। पाठक 13,14,15 में पैटर्निंग प्रक्रिया पर उपर्युक्त मापदंडों के प्रभाव का एक विस्तृत विवरण पा सकता है। मूल एससीएपीए प्रौद्योगिकी 13,14,15 में, कोलाइडल पैटर्निंग प्रक्रिया को एक खुली प्रणाली में किया गया था और टेम्पलेट में निलंबन को चलाने के लिए एक उच्च-परिशुद्धता पीजोइलेक्ट्रिक चरण की आवश्यकता थी। यह प्लेटफ़ॉर्म एक अलग रणनीति का शोषण करता है और पैटर्निंग को एक नियंत्रित वातावरण में आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक्स में उपयोग किए जाने वाले मानक उपकरणों के साथ किए जाने की अनुमति देता है, इस प्रकार नमूनों को दूषित करने के जोखिम को कम करता है।
इस माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म को पहले कोलाइडल कणों पर अनुकूलित किया गया था ताकि अक्रिय कणों की नियमित सरणियां बनाई जा सकें और फिर सफलतापूर्वक बैक्टीरिया पर लागू किया जा सके। दोनों माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों को इस पेपर में वर्णित किया गया है (चित्रा 1 बी, सी)। प्रोटोकॉल में वर्णित अधिकांश प्रारंभिक चरण और प्रयोगात्मक उपकरण दो अनुप्रयोगों (चित्रा 2) के लिए आम हैं। हम कोलाइडल पैटर्निंग की रिपोर्ट करते हैं ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि तकनीक का उपयोग जटिल, मल्टीमटेरियल पैटर्न बनाने के लिए एक ही सतह पर कई अनुक्रमिक जमाव करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, एक विशिष्ट ज्यामिति और संरचना के साथ कोलाइडल सरणियों को बनाने के लिए प्रत्येक चरण के लिए एक एकल कण प्रति जाल जमा किया गया था, जो पूरी तरह से जाल की ज्यामिति और भरने के अनुक्रम द्वारा निर्धारित किया गया था। बैक्टीरियल पैटर्निंग के लिए, एकल जमाव का वर्णन किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रति जाल एक जीवाणु जमा होता है। एक बार जब कोशिकाओं को सतह पर पैटर्न किया जाता है, तो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को बैक्टीरिया के विकास को बढ़ावा देने के लिए माध्यम के साथ फ्लश किया जाता है, जो किसी भी एकल-सेल अध्ययन का प्रारंभिक चरण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म सूक्ष्म आकार की वस्तुओं, जैसे कोलाइड्स और बैक्टीरिया के पैटर्निंग को पीडीएमएस सब्सट्रेट पर निर्धारित स्थानिक व्यवस्था में अनुमति देता है। माइक्रोफ्लुइडि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक SNSF PRIMA अनुदान 179834 (ई.एस.), एक ETH अनुसंधान अनुदान ETH-15 17-1 (R. S.), और एक गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अन्वेषक पुरस्कार जलीय माइक्रोबियल सिम्बायोसिस (अनुदान GBMF9197) (आर.एस.) पर एक गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अन्वेषक पुरस्कार से समर्थन स्वीकार करते हैं। लेखकों ने बैक्टीरिया के SEM इमेजिंग के लिए और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए डॉ मिगुएल एंजेल फर्नांडीज-रोड्रिग्ज (ग्रेनाडा, स्पेन विश्वविद्यालय) को धन्यवाद दिया। लेखकों ने डॉ जेन गुयेन (ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय, कनाडा), डॉ लौरा अल्वारेज़ (ईटीएच ज़ुरिच, स्विट्जरलैंड), कैमरून बोगन (ईटीएच ज़्यूरिच, स्विट्जरलैंड) और डॉ फैबियो ग्रिलो को व्यावहारिक चर्चाओं के लिए धन्यवाद दिया।
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
Riferimenti
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