シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング
Summary
マイクロ流体プラットフォーム内の毛細管現象支援アセンブリを用いて、細菌やコロイドなどの液体中に浮遊するマイクロサイズの物体をポリジメチルシロキサン基板上の所定のアレイにパターニングする技術を提示する。
Abstract
定義された空間配置への微生物の制御されたパターニングは、微生物生理学および相互作用の研究を含む、広範囲の生物学的用途のためのユニークな可能性を提供する。最も単純なレベルでは、微生物の正確な空間パターニングは、多数の個々の細胞の信頼性の高い長期イメージングを可能にし、距離依存の微生物 – 微生物相互作用を定量的に研究する能力を変革する。よりユニークなことに、マイクロ流体技術によって提供される正確な空間パターニングと環境条件の完全な制御を組み合わせることで、微生物生態学における単一細胞研究のための強力で汎用性の高いプラットフォームが提供されます。
このホワイトペーパーでは、マイクロ流体チャネル内で微生物の汎用性とユーザー定義のパターンを生成し、長期的かつ高スループットのモニタリングのための完全な光アクセスを可能にするマイクロ流体プラットフォームを紹介します。この新しいマイクロ流体技術は、毛細管現象支援粒子アセンブリに基づいており、マイクロ流体チャネル内の蒸発懸濁液の制御された動きから生じる毛細管力を利用して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上に微細化されたトラップのアレイに個々のマイクロサイズの物体を堆積させる。シーケンシャルデポジションは、トラップのジオメトリと充填シーケンスによってのみ決定される、単一または複数のタイプのマイクロサイズのオブジェクトの所望の空間レイアウトを生成する。
プラットフォームは、異なる寸法および材料のコロイド粒子を使用して較正されており、多様なコロイドパターンを生成し、捕捉された粒子の表面官能化を実行するための強力なツールであることが証明されています。さらに、プラットフォームを微生物細胞上で試験し、モデル細菌として 大腸菌 細胞を使用した。何千もの個々の細胞を表面にパターン化し、その成長を経時的にモニターした。このプラットフォームでは、単一細胞堆積とマイクロ流体技術を組み合わせることで、微生物の幾何学的パターニングと環境条件の正確な制御の両方が可能になります。したがって、予備実験によって示されているように、単一の微生物の生理学と微生物と微生物の相互作用の生態学への窓が開かれます。
Introduction
単一の微生物の空間パターニングは、特にマイクロ流体デバイスなどの環境条件を完全に制御できる実験分野では、幅広い文脈で非常に望ましい。例えば、微生物を規則的な配列に配置することで、多数の個々の細胞を正確にイメージングし、それらの増殖、生理機能、環境刺激に応答した遺伝子発現、および薬物感受性の研究を可能にする。また、細胞コミュニケーション(例えば、クォーラムセンシング)、交配(例えば、藻類 – 細菌共生)、または拮抗作用(例えば、アレロパシー)に関する研究において特に関心のある細胞間相互作用を研究することを可能にする。細胞生理・進化研究1、細胞間相互作用研究2、表現型分化スクリーニング3、環境モニタリング4、薬物スクリーニング5 は、このような定量的単一細胞解析を実現できる技術から大きな恩恵を受けることができる分野の一つです。
近年、ホログラフィック光学トラップ6および不均一な表面機能化方法7,8,9,10から単一細胞ケモスタット11および液滴マイクロ流体12まで、単一細胞を単離および処理するためのいくつかの戦略が提案されている。これらの方法は、技術的に非常に要求が厳しいか、細胞生理機能に影響を与え、長期間にわたって研究できる微生物をパターン化するための高スループットプラットフォームを提供しず、単一セル分解能、完全な光学アクセス、および環境条件の制御を保証します。この論文の目標は、毛細管現象支援アセンブリを介してPDMS表面上の所定の空間配置にマイクロメトリック精度で細菌をパターン化するプラットフォームを記述することです。このプラットフォームは、微生物の正確で柔軟な空間パターニングを可能にし、そのマイクロ流体の性質のおかげで、環境条件に対する完全な光学アクセスと制御を可能にします。
このプラットフォームの背後にある技術は、マイクロ流体プラットフォーム16に統合されたsCAPA13,14,15(シーケンシャルキャピラリーアシスト粒子アセンブリ)と名付けられた近年開発されたアセンブリ技術です。蒸発する液滴のメニスカスは、マイクロ流体チャネル内のパターン化されたポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上を後退しながら、液体中に懸濁した個々のコロイド粒子を基板上に微細化されたマイクロメトリックウェルにトラップする毛細管力を発揮する(図1A)。懸濁粒子は、最初に対流電流によって気液界面に輸送され、次いで毛細管現象によってトラップに入れられる。移動メニスカスによって加えられる毛細血管力は、粒子相互作用に関与する力と比較して、より大きなスケールで作用する。
したがって、アセンブリ機構は、粒子の材料、寸法、および表面特性の影響を受けない。粒子濃度、メニスカスの速度、温度、懸濁液の表面張力などのパラメータは、パターニングプロセスの収率に影響を与える唯一のパラメータです。読者は、パターニングプロセスに対する前述のパラメータの影響の詳細な説明をin13、14、15で見つけることができる。オリジナルのsCAPA技術13,14,15では、コロイドパターニングプロセスはオープンシステムで行われ、テンプレートを横切ってサスペンションを駆動するために高精度の圧電ステージが必要でした。このプラットフォームは、異なる戦略を活用し、制御された環境でマイクロフルイディクスで一般的に使用される標準機器でパターニングを実行できるため、サンプルを汚染するリスクを最小限に抑えることができます。
このマイクロ流体プラットフォームは、まずコロイド粒子上で最適化され、不活性粒子の規則的な配列を作成し、その後細菌に首尾よく適用されました。このホワイトペーパーでは、両方のマイクロ流体プラットフォームについて説明します(図1B、C)。プロトコルに記載されている準備ステップと実験装置のほとんどは、2つのアプリケーションで共通です(図2)。我々は、コロイドパターニングを報告して、この技術を使用して同じ表面上で複数の連続的な堆積を行い、複雑でマルチマテリアルパターンを作成できることを実証する。特に、各ステップごとに1つの単一粒子を堆積させて、トラップの形状および充填シーケンスによってのみ決定される特定の形状および組成を有するコロイド配列を形成する。細菌のパターニングに関しては、単一の堆積が記載されており、その結果、トラップごとに1つの細菌が堆積する。細胞が表面にパターニングされると、マイクロ流体チャネルは、細菌増殖を促進するために培地でフラッシュされる、任意の単一細胞研究の予備段階である。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するマイクロ流体プラットフォームは、コロイドや細菌などのマイクロサイズの物体をPDMS基板上の所定の空間配置にパターニングすることを可能にする。マイクロフルイディクスが提供する環境条件を完全に制御し、sCAPA技術によって付与されたマイクロメトリック精度で細胞をパターン化する能力により、将来の生理学および生態学研究にとって非常に有望なプラットフォーム?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
Riferimenti
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
