Denne protokollen beskriver en metode for å etablere en human blod-hjernebarriere (BBB) in vitro-modell . Endotelceller og pericytter blir sådd på hver side av et innsatsfilter (blodrom), og astrocytter blir sådd i bunnbrønnen (hjernekammeret). Den karakteriserte modellen ble brukt til nanopartikler transporteksperimenter.
Levering av medisiner til hjernen er fortsatt en utfordring på grunn av blod-hjernebarrierens (BBB) svært spesifikke og restriktive egenskaper, som kontrollerer og begrenser tilgangen til hjernens parenkym. Men med utviklingen av nanoteknologi ble store paneler av nye nanomaterialer utviklet for å forbedre legemiddellevering, og fremhever behovet for pålitelige in vitro mikrosystemer for å forutsi hjernepenetrasjon i rammen av prekliniske analyser. Her er en enkel metode for å sette opp et mikrofysiologisk system for å modellere BBB ved hjelp av utelukkende menneskelige celler. I sin konfigurasjon består modellen av en trippelkultur inkludert hjernelignende endotelceller (BLAC), pericytter og astrocytter, de tre viktigste BBB-cellulære aktørene som er nødvendige for å indusere og regulere BBB-egenskapene på en mer fysiologisk måte uten krav om strammeforbindelser. Modellen utviklet i et 12-brønns plateformat, klar etter 6 dager med trippelkultur, karakteriseres i fysiske egenskaper, gen og proteinuttrykk og brukes til polymer nanogeltransportmåling. Modellen kan brukes til et omfattende spekter av eksperimenter i friske og patologiske tilstander og representerer et verdifullt verktøy for prekliniske vurderinger av molekyl- og partikkeltransport, samt inter- og intracellulær handel.
BBB, lokalisert på nivå med hjernens kapillære endotelceller (ECs), kontrollerer og regulerer tilgangen til hjernens parenchyma, noe som er avgjørende for å opprettholde hjernehomeostase og funksjonen til nevrale celler 1,2. Men når det gjelder hjernepatologi, representerer mangelen på tilgang til hjernens parenchyma et reelt hinder for å utvikle terapeutiske strategier.
BBB ECs har et komplekst sett med egenskaper, inkludert tette kryssproteiner (TJ), som forsegler det intercellulære rommet, assosiert med et system med efflukspumper, spesifikke transportører og reseptorer, som styrer den transcellulære banen 1,2,3. Videre er alle disse egenskapene indusert og vedlikeholdt, takket være kommunikasjon med pericytter innebygd i BBB EC kjellermembranen og astrocytter, hvis endeføtter omgir hjernekapillærene 1,2,3. Derfor er det en utfordring å studere BBB in vitro med tanke på kompleksiteten i arkitekturen og kommunikasjonen mellom de forskjellige celletypene som utgjør den nevrovaskulære enheten (NVU)2. Videre er de forskjellige celletypene avgjørende for induksjon og vedlikehold av BBB-egenskaper og følgelig påvirker prediksjonen av krysset gjennom BBB. Ulike strategier for legemiddellevering til hjernen ble allerede testet ved hjelp av et stort panel av taktikker for å omgå BBB-begrensede egenskaper4. Mer nylig, med utviklingen av nanoteknologi, utvikles nye materialer for applikasjoner som legemiddelbærere 5,6. I tillegg til høyere belastning, redusert toksisitet og økt biotilgjengelighet av legemidler, kan disse nye nanomaterialene funksjonaliseres for en trojansk hestestrategi for å krysse BBB og spesifikt målrette celler i parenchyma 5,6. Blant de forskjellige typer nanomaterialer som evalueres, har nanogeler tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet, hovedsakelig på grunn av deres kolloidale egenskaper og evne til å skreddersy den kjemiske strukturen for å introdusere stimuli-responsive egenskaper 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
In vitro-modeller er nå utviklet for prekliniske studier ved bruk av humane celler for å forutsi hjernepenetrasjon av legemidler16. Ulike innstillinger av disse modellene er tilgjengelige, fra monolayers av hjerne-ECs til flere cellesystemer16. Med tanke på betydningen av NVU-cellene i BBB-induksjon og vedlikehold og koordinert respons på det patologiske miljøet, må BBB in vitro-modeller vurdere alle disse hovedpersonene for å forbedre relevansen av prediksjonen 2,17.
Den nåværende metoden beskriver å sette opp en trippelkultur in vitro-modell av den menneskelige BBB, som er fullt utviklet med humane celler for å studere spesifikke cellulære og humane molekylære mekanismer. For å være fysiologisk relevant består modellen av de tre viktigste cellulære aktørene til BBB (ECs, pericytter og astrocytter) som er nødvendige for å indusere og opprettholde BBB-egenskapene, uten bruk av strammeforbindelser og viser et sett med egenskaper som kreves for å bli betraktet som en in vitro BBB modell16,18. Modellen er satt opp i en konfigurasjon som avgrenser blodet og hjernerommet, egnet for prekliniske studier av legemiddel- og partikkeltransport for å forutsi hjernepenetrasjon. Nytten av modellen illustreres ved å måle transporten av polymere nanogeler.
Behandling av hjernesykdommer er fortsatt en utfordring med tanke på vanskeligheten av stoffene å hindre over BBB for å nå sine cellulære og molekylære mål i hjernen parenchyma.
Narkotikautvikling for hjernesykdommer viser for tiden en lav suksessrate siden de fleste legemidler som viser lovende resultater i prekliniske modeller, ikke viste noen fordel når de brukes i klinikken. Etter “3R-regelen”, som tar sikte på å redusere antall dyr som brukes til eksperimentering, utvikles in vitro-modeller av BBB for å studere hjernepatologier og for å forutsi hjernepenetrasjon av legemidler29. In vitro-modeller av BBB har hovedsakelig blitt utviklet ved hjelp av dyreceller og har blitt mer sofistikerte for å forbedre relevansen av de oppnådde resultatene16. En av de betydelige fremskrittene i bruken av humane celler, som gir ubestridelig ny innsikt og mer spesifisitet, på cellulært og molekylært nivå, for å studere menneskelige sykdomsmekanismer16. Utviklingen av relevante modeller krever imidlertid å vurdere forbedringen av BBB in vitro-modellinnstillingene og kunnskapen som oppstår, takket være dyremodeller. Derfor må den vurdere kompleksiteten til BBB-arkitekturen og betydningen av celle-cellekommunikasjonen for å studere BBB under fysiologiske og patologiske forhold30.
Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å sette opp en full human BBB in vitro-modell som består av de tre hovedcelletypene til BBB, uten begrensning av tilgang til hjernevev. Som et flercellesystem er induksjon og vedlikehold av BBB-egenskaper, uten kunstig bruk av strammeforbindelser, men i stedet indusert av celle-cellekommunikasjon, mer fysiologisk relevant og i tråd med in vivo-induksjonen av BBB-egenskapene31. Derfor er respekten for kronologien til protokollen av største betydning for protokollens suksess. Videre representerer inkubasjonstidene under innstillingen av trippelkulturen og når de tre celletypene er samlet, de viktigste kritiske trinnene i protokollen.
BBB-egenskapene i ECs induseres av samkulturen med pericytter, som beskrevet for samkulturmodellen24. Derfor er kulturen av pericytter på baksiden av innsatsfilteret det mest kritiske punktet og krever strengt å følge protokollen med risiko for ikke å ha nok pericytter for induksjon av BBB-egenskapene. Først av alt, under beleggprosedyren og også cellesåing, må det tas hensyn til ikke å ha dekselet til petriskålen i kontakt med belegget og også mediet når cellene er sådd for å sikre et godt belegg av filteret og ikke å miste celler (trinn 2.2.1 og 2.2.4). Videre, når pericytter er sådd, er det viktig å vente den angitte tiden for vedlegg av pericyttene (trinn 2.2.4) før du tilbakestiller innsatsfilteret for belegg og såing av ECs på den andre siden (trinn 2.2.5 og 2.3). Når det er sådd, kreves det seks dager for å indusere BBB-egenskapene gjennom celle-cellekommunikasjon (trinn 2.4).
Modellen er validert når det gjelder begrenset permeabilitet (knyttet til innstillingen av de tette kryssene) siden EC-ene i trippelkulturmodellen viser permeabilitetsverdier til BBB-integritetsmarkører som ligner på den validerte samkulturmodellen og også målt i validerte dyre- eller menneskemodeller 16,27,32. Videre krever valideringen av en in vitro BBB-modell, i tillegg til den begrensede permeabiliteten, responsen til andre celletyper av NVU og uttrykket av funksjonelle reseptorer og transportører16. I tillegg er modellen reproduserbar og produserer flere innsatsfiltre og brønner for å utføre mange analyser (gen- og proteinuttrykk, fluorescerende farging, toksisitetstester) på hver celletype separat uten å kreve en cellesorteringsmetode.
Modellen ble utviklet ved hjelp av et 0,4 μm porestørrelsesfilter for å ha en celletype på hver side av innsatsfilteret. Innsatsfiltersystemet tillot studier av celle-cellekommunikasjon under fysiologiske forhold ved å overføre det på godt inneholdende astrocytter. Tilstedeværelsen av astrocytter i systemet representerer en merverdi sammenlignet med den opprinnelige samkulturen in vitro modell24. Faktisk, med tanke på betydningen av astrocytter i BBBs fysiologi, tillater denne tredje celletypen ytterligere forståelse av celle-cellekommunikasjonen i BBB. Videre kan trippelcellekultursystemet også studeres under patologiske forhold som slag, hvor astrocytter spiller en viktig rolle33,34,35. I tillegg kan utformingen av BLAC/pericytter på begge sider av innsatsfilteret enkelt plasseres på andre celletyper for å etterligne patologiske tilstander som hjernekreft23.
Porestørrelsen på innsatsfilteret kan gi begrensninger med noen eksperimenter, for eksempel celletransmigrasjon over BBB. Utviklingen av modellen med større porestørrelse krever imidlertid tilpasning av protokollen for å sikre dannelsen av et fysiologisk monolag av ECs og ikke flere lag, noe som ikke er fysiologisk relevant for å etterligne BBB36.
Modellens anvendelighet har blitt demonstrert ved hjelp av NGs transporteksperiment som viser muligheten til å gjøre transporteksperiment ved hjelp av et flercellet system. Likevel bør man være klar over vanskelighetene med å ha en kontrollforbindelse eller et molekyl for transporteksperimentet, og dele sammenlignbare egenskaper med NGs siden hver nanostruktur utviser et unikt sett med egenskaper (molekylvekt, ladning, form, fysiske egenskaper, proteinkoronadannelse).
En begrensning av modellen er fraværet av skjærspenning, som ble vist å påvirke differensieringen av ECs og uttrykket av TJ-proteiner37. Imidlertid er det utfordrende å utvikle et fluidisk system som etterligner hjernekapillæren med tanke på kompleksiteten ved å legge til en fluidisk del, som krever en bestemt enhet, i et flercellesystem. Videre er den spesielle enheten vanligvis ikke kommersielt tilgjengelig og tillater ikke mange repliker, noe som gjør fluidiske systemer mindre tilpasset for bruk med høy gjennomstrømning.
Oppsummert reproduserer dette trippelkultursystemet bestående av menneskelige celler in vitro arkitekturen til BBB. Det tillater generering av mange innlegg som kan brukes til omfattende screening av forbindelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er gitt av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale No 764958, som en del av NANOSTEM-prosjektet, et Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Denne studien er gitt av ‘Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais’ (Fellowship to Clémence Deligne), “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent” (SFCE), Association “l’étoile de Martin” og Association “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |