Monitoring van darmverzuring in de drosophila-darm van volwassenen
Summary
Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het monitoren van darmverzuring in Drosophila melanogaster met optimale output. We gebruiken dit protocol eerst voor darmverzuringsmonitoring bij Drosophila melanogaster en demonstreren vervolgens het gebruik ervan in niet-model Drosophila-soorten .
Abstract
De fruitvlieg midgut bestaat uit meerdere regio’s, die elk zijn samengesteld uit cellen die unieke fysiologische functies uitvoeren die nodig zijn voor de goede werking van de darm. Een dergelijk gebied, het kopercelgebied (CCR), is gelokaliseerd in het middelste middengut en bestaat gedeeltelijk uit een groep cellen die bekend staat als kopercellen. Kopercellen zijn betrokken bij maagzuursecretie, een evolutionair geconserveerd proces waarvan de precieze rol slecht wordt begrepen. Dit artikel beschrijft verbeteringen in het huidige protocol dat wordt gebruikt om te testen op verzuring van de volwassen Drosophila melanogaster-darm en toont aan dat het kan worden gebruikt op andere soorten vliegen. In het bijzonder toont dit artikel aan dat darmverzuring afhankelijk is van de voedingsstatus van de vlieg en presenteert een protocol op basis van deze nieuwe bevinding. Over het algemeen toont dit protocol het potentiële nut aan van het bestuderen van Drosophila-kopercellen om algemene principes te ontdekken die ten grondslag liggen aan de mechanismen van darmverzuring.
Introduction
In de insectendarm delen kopercellen cellulaire en functionele overeenkomsten met de zuurproducerende maagpariëtale cellen (ook bekend als oxyntisch) van de zoogdiermaag. Deze groep cellen geeft zuur af in het darmlumen. De functie van zuursecretie en anatomie is evolutionair geconserveerd. De belangrijkste componenten van het geloosde zuur zijn zoutzuur en kaliumchloride. Het chemische mechanisme van zuurvorming in de cellen is afhankelijk van koolzuuranhydrase. Dit enzym genereert een bicarbonaation uit CO2 en water, dat een hydroxylion vrijmaakt dat vervolgens via een protonpomp in het lumen wordt afgevoerd in ruil voor kalium. Chloride- en kaliumionen worden via geleidingskanalen in het lumen getransporteerd, wat resulteert in de vorming van zoutzuur en kaliumchloride, het hoofdbestanddeel van maagsap1,2,3,4.
Hoewel de mechanismen van zuurvorming goed worden begrepen, is er veel minder bekend over de fysiologische mechanismen die de zuursecretie reguleren. Het doel van het ontwikkelen van deze methode is om de cellulaire routes die zuurvorming en secretie coördineren beter af te bakenen en de rol van zuur bij het bemiddelen van darmfysiologie en homeostase te bepalen. De reden achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om een consistente en betrouwbare methode te bieden om het proces van darmverzuring in Drosophila en niet-modelorganismen te bestuderen. Hoewel er momenteel een standaardprotocol bestaat voor het bepalen van Drosophila midgut-verzuring2,5,6, werd een significante variabiliteit waargenomen in de mate van verzuring bij wildtype (WT) vliegen tijdens het gebruik van dit protocol voor het bestuderen van de kopercelfunctie. Om de basis voor deze waargenomen variabiliteit te begrijpen en consistente resultaten te verkrijgen, werden verschillende aspecten van het standaardprotocol geoptimaliseerd zoals hieronder beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een cruciale stap in dit protocol is de juiste dissectie van de darm om de CCR voor het verzuringsfenotype te visualiseren. Het zuur dat vrijkomt uit de kopercellen is beperkt tot de CCR wanneer de darm intact is. Tijdens dissectie kan lekkage veroorzaakt door scheuring van de darm echter leiden tot diffusie van zuur uit de CCR en resulteren in een darm die ten onrechte als negatief wordt gescoord voor verzuring. Bovendien vervaagt de gele kleur die wijst op verzuring binnen 5-10 minuten na dissectie, wat het belang onde…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen dat ondersteuning voor werk in het laboratorium van de auteur wordt geboden door een HHMI Faculty Scholar Award en start-upfondsen van het Children’s Research Institute aan het UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
Riferimenti
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend, , et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell, , et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
