Surveillance de l’acidification intestinale dans l’intestin de la drosophile adulte

Summary

Ici, nous présentons un protocole standardisé pour surveiller l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster avec un rendement optimal. Nous utilisons d’abord ce protocole pour la surveillance de l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster , puis démontrons son utilisation chez les espèces de drosophila non modèles.

Abstract

L’intestin moyen de la mouche des fruits se compose de plusieurs régions, chacune composée de cellules qui remplissent des fonctions physiologiques uniques nécessaires au bon fonctionnement de l’intestin. L’une de ces régions, la région des cellules de cuivre (CCR), est localisée dans l’intestin moyen et se compose, en partie, d’un groupe de cellules appelées cellules de cuivre. Les cellules de cuivre sont impliquées dans la sécrétion d’acide gastrique, un processus conservé de manière évolutive dont le rôle précis est mal compris. Cet article décrit les améliorations apportées au protocole actuel utilisé pour tester l’acidification de l’intestin adulte de Drosophila melanogaster et démontre qu’il peut être utilisé sur d’autres espèces de mouches. En particulier, cet article démontre que l’acidification intestinale dépend de l’état nutritionnel de la mouche et présente un protocole basé sur cette nouvelle découverte. Dans l’ensemble, ce protocole démontre l’utilité potentielle de l’étude des cellules de cuivre de la drosophile pour découvrir les principes généraux sous-jacents aux mécanismes de l’acidification intestinale.

Introduction

Dans l’intestin de l’insecte, les cellules de cuivre partagent des similitudes cellulaires et fonctionnelles avec les cellules pariétales gastriques productrices d’acide (également appelées oxyntiques) de l’estomac des mammifères. Ce groupe de cellules libère de l’acide dans la lumière intestinale. La fonction de la sécrétion acide et de l’anatomie est conservée de manière évolutive. Les principaux composants de l’acide rejeté sont l’acide chlorhydrique et le chlorure de potassium. Le mécanisme chimique de formation d’acide dans les cellules dépend de l’anhydrase carbonique. Cette enzyme génère un ion bicarbonate à partir du _CO2 et de l’eau, qui libère un ion hydroxyle qui est ensuite rejeté dans la lumière par une pompe à protons en échange de potassium. Les ions chlorure et potassium sont transportés dans la lumière par des canaux de conductance entraînant la formation d’acide chlorhydrique et de chlorure de potassium, le composant principal du suc gastrique1,2,3,4.

Bien que les mécanismes de formation d’acide soient bien compris, on en sait beaucoup moins sur les mécanismes physiologiques qui régulent la sécrétion d’acide. L’objectif du développement de cette méthode est d’aider à mieux délimiter les voies cellulaires qui coordonnent la formation et la sécrétion d’acide et de déterminer le rôle de l’acide dans la médiation de la physiologie intestinale et de l’homéostasie. La raison d’être du développement et de l’utilisation de cette technique est de fournir une méthode cohérente et fiable pour étudier le processus d’acidification intestinale chez la drosophile et les organismes non modèles. Bien qu’il existe actuellement un protocole standard pour déterminer l’acidification de l’intestin moyen de la drosophile2,5,6, une variabilité significative a été observée dans l’étendue de l’acidification chez les mouches de type sauvage (WT) lors de l’utilisation de ce protocole pour étudier la fonction des cellules de cuivre. Pour comprendre la base de cette variabilité observée et obtenir des résultats cohérents, plusieurs aspects du protocole standard ont été optimisés comme décrit ci-dessous.

Protocol

REMARQUE: La ligne de laboratoire standard Oregon R a été utilisée comme contrôle WT. Toutes les mouches ont été élevées sur un milieu standard de semoule de maïs et de mélasse (contenant de la mélasse, de la gélose, de la levure, de la semoule de maïs, du tegosept, de l’acide propionique et de l’eau) à température ambiante avec un rythme circadien clair/foncé de 12/12 h. 1. Préparation au test Recueillir les mouches femelles (âgées de 0 à 2 j…

Representative Results

Nous avons affamé les mouches femelles oregon R pendant plus de 20 heures, puis nous les avons nourries avec de la nourriture supplémentée en BPB (2%) pendant environ 12 heures, comme décrit précédemment7,8,9,10,11. Le bleu de bromophénol (BPB) est un colorant qui détecte le pH. Il passe du jaune à un pH de 3,0 au bleu à un pH de 4,6 et plus. Après …

Discussion

Une étape critique de ce protocole est la dissection appropriée de l’intestin pour visualiser le CCR pour le phénotype d’acidification. L’acide libéré par les cellules de cuivre est confiné au CCR lorsque l’intestin est intact. Cependant, lors de la dissection, une fuite causée par une rupture de l’intestin peut entraîner la diffusion de l’acide du CCR et entraîner un intestin marqué par erreur comme négatif pour l’acidification. En outre, la couleur jaune indicative de l’acidification s’esto…

Materials

Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification