ניטור החמצת מעיים במעי דרוזופילה למבוגרים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מתוקנן לניטור החמצת המעיים ב Drosophila melanogaster עם תפוקה אופטימלית. תחילה אנו משתמשים בפרוטוקול זה לניטור החמצת המעיים ב – Drosophila melanogaster ולאחר מכן מדגימים את השימוש בו במינים שאינם מודל Drosophila .
Abstract
מידגוט זבוב הפירות מורכב מאזורים מרובים, שכל אחד מהם מורכב מתאים המבצעים פונקציות פיזיולוגיות ייחודיות הנדרשות לתפקוד תקין של המעיים. אזור אחד כזה, אזור תא הנחושת (CCR), הוא מקומי לאמצע midgut והוא מורכב, בחלקו, של קבוצה של תאים המכונה תאי נחושת. תאי נחושת מעורבים בהפרשת חומצת קיבה, תהליך שנשמר אבולוציונית שתפקידם המדויק אינו מובן כהלכה. מאמר זה מתאר שיפורים בפרוטוקול הנוכחי המשמש לבדיקת החמצה של המעיים הבוגרים Drosophila melanogaster ומדגים כי ניתן להשתמש בו על מינים אחרים של זבובים. בפרט, מאמר זה מדגים כי החמצת המעיים תלויה במצב התזונתי של הזבוב ומציג פרוטוקול המבוסס על ממצא חדש זה. בסך הכל, פרוטוקול זה מדגים את התועלת הפוטנציאלית של לימוד תאי נחושת Drosophila לחשוף עקרונות כלליים שבבסיס המנגנונים של החמצת המעיים.
Introduction
במעי החרקים, תאי נחושת חולקים קווי דמיון תאיים ותפקודיים עם תאי קודקוד הקיבה המייצרים חומצה (הידועים גם בשם אוקסינטי) של הקיבה היונקת. קבוצת תאים זו משחררת חומצה לתוך לומן המעי. הפונקציה של הפרשת חומצה ואנטומיה נשמרת אבולוציונית. המרכיבים העיקריים של החומצה המשוחררת הם חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד. המנגנון הכימי של היווצרות חומצה בתאים תלוי באנהידרז פחמתי. אנזים זה מייצר יון ביקרבונט מפחמן דו-חמצני ומים, אשר משחרר יון הידרוקסיל כי הוא משוחרר לאחר מכן לתוך הלומן באמצעות משאבת פרוטון בתמורה אשלגן. יוני כלוריד ואשלגן מועברים לתוך הלומן על ידי ערוצי מוליכות וכתוצאה מכך היווצרות של חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד, המרכיב העיקרי של מיץ קיבה1,2,3,4.
למרות המנגנונים של היווצרות חומצה מובנים היטב, הרבה פחות ידוע על מנגנונים פיזיולוגיים המסדירים הפרשת חומצה. המטרה של פיתוח שיטה זו היא לעזור לתאר טוב יותר את המסלולים התאיים המתאמים היווצרות חומצה והפרשת ולקבוע את תפקידה של חומצה בתיווך פיזיולוגיה מעיים והומאוסטזיס. הרציונל מאחורי ההתפתחות והשימוש בטכניקה זו הוא לספק שיטה עקבית ואמינה ללמוד את תהליך החמצת המעיים בדרוזופילה ואורגניזמים שאינם מודל. למרות פרוטוקול סטנדרטי לקביעת חמצת midgut Drosophila קיים כיום 2,5,6, שונות משמעותית נצפתה במידת החמצה זבובים מסוג בר (WT) בעת שימוש בפרוטוקול זה לחקר תפקוד תאי נחושת. כדי להבין את הבסיס לשונות נצפתה זו ולקבל תוצאות עקביות, מספר היבטים של הפרוטוקול הסטנדרטי היו ממוטבים כמתואר להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעד קריטי בפרוטוקול זה הוא החיתוך הנכון של המעיים כדי לדמיין את CCR עבור פנוטיפ החמצה. החומצה המשתחררת מתאי הנחושת מוגבלת ל- CCR כאשר המעיים שלמים. עם זאת, במהלך ניתוח, דליפה הנגרמת על ידי קרע של המעי יכול להוביל דיפוזיה של חומצה מן CCR ולגרום המעי בטעות ציון שלילי עבור החמצה. בנוסף, הצבע הצהוב המ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בכך שהתמיכה בעבודה במעבדה של המחבר ניתנת על ידי פרס חוקר הפקולטה של HHMI וקרנות סטארט-אפ ממכון המחקר לילדים במרכז הרפואי UT Southwestern.
Materials
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
Riferimenti
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend, , et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell, , et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
