Her presenterer vi en standardisert protokoll for overvåking av tarmforsuring i Drosophila melanogaster med optimal effekt. Vi bruker først denne protokollen for tarmforsuringsovervåking i Drosophila melanogaster og demonstrerer deretter bruken i ikke-modell Drosophila-arter .
Fruktfluen midgut består av flere regioner, som hver består av celler som utfører unike fysiologiske funksjoner som kreves for riktig funksjon av tarmen. En slik region, kobbercelleområdet (CCR), er lokalisert til midten av midgut og består delvis av en gruppe celler kjent som kobberceller. Kobberceller er involvert i gastrsyresekresjon, en evolusjonær konservert prosess hvis presise rolle er dårlig forstått. Dette dokumentet beskriver forbedringer i den nåværende protokollen som brukes til å analyse for forsuring av den voksne Drosophila melanogaster tarmen og viser at den kan brukes på andre arter av fluer. Spesielt viser dette papiret at tarmforsuring er avhengig av flyets ernæringsstatus og presenterer en protokoll basert på dette nye funnet. Samlet sett viser denne protokollen den potensielle nytten av å studere Drosophila kobberceller for å avdekke generelle prinsipper som ligger til grunn for mekanismene for tarmforsuring.
I insekts tarmen deler kobberceller cellulære og funksjonelle likheter med de syreproduserende mageparietalcellene (også kjent som oksytisk) av pattedyrets mage. Denne gruppen av celler frigjør syre i tarmlumen. Funksjonen av syresekresjon og anatomi er evolusjonært bevart. De viktigste komponentene i den utladede syren er saltsyre og kaliumklorid. Den kjemiske mekanismen for syredannelse i cellene avhenger av karbonanhydrase. Dette enzymet genererer en bikarbonation fra CO2 og vann, som frigjør en hydroksylion som deretter slippes ut i lumen gjennom en protonpumpe i bytte mot kalium. Klorid- og kaliumioner transporteres inn i lumen ved konduktivanskanaler som resulterer i dannelse av saltsyre og kaliumklorid, hovedkomponenten i magesaft1,2,3,4.
Selv om mekanismene for syredannelse er godt forstått, er mye mindre kjent om de fysiologiske mekanismene som regulerer syresekresjon. Målet med å utvikle denne metoden er å bidra til bedre å avgrense de cellulære banene som koordinerer syredannelse og sekresjon og bestemmer syrens rolle i å formidle tarmfysiologi og homeostase. Begrunnelsen bak utviklingen og bruken av denne teknikken er å gi en konsekvent og pålitelig metode for å studere prosessen med tarmforsuring i Drosophila og ikke-modellorganismer. Selv om en standardprotokoll for å bestemme Drosophila midgut-forsuring for tiden eksisterer2,5,6, ble det observert betydelig variasjon i omfanget av forsuring i villtype (WT) fluer mens du bruker denne protokollen for å studere kobbercellefunksjon. For å forstå grunnlaget for denne observerte variasjonen og oppnå konsistente resultater, ble flere aspekter av standardprotokollen optimalisert som beskrevet nedenfor.
Et kritisk skritt i denne protokollen er riktig disseksjon av tarmen for å visualisere CCR for forsuring fenotype. Syren som frigjøres fra kobbercellene er begrenset til CCR når tarmen er intakt. Men under disseksjonen kan lekkasje forårsaket av brudd i tarmen føre til diffusjon av syre fra CCR og resultere i at tarmen feilaktig skårer som et negativt for forsuring. I tillegg falmer den gule fargen som indikerer forsuring innen 5-10 min etter disseksjon, og understreker viktigheten av å score tarmer for forsurings…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner at støtte til arbeid i forfatterens laboratorium er gitt av en HHMI Faculty Scholar Award og oppstartsmidler fra Children’s Research Institute ved UT Southwestern Medical Center.
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |