Monitoramento da acidificação intestinal no intestino de Drosophila adulto

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para monitoramento da acidificação intestinal em Drosophila melanogaster com ótima saída. Primeiro usamos este protocolo para monitoramento da acidificação intestinal em Drosophila melanogaster e, em seguida, demonstramos seu uso em espécies não-modelo de Drosophila .

Abstract

O midgut mosca-das-frutas consiste em múltiplas regiões, cada uma das quais é composta de células que realizam funções fisiológicas únicas necessárias para o bom funcionamento do intestino. Uma dessas regiões, a região da célula de cobre (CCR), é localizada até o meio médio e consiste, em parte, de um grupo de células conhecidas como células de cobre. As células de cobre estão envolvidas na secreção do ácido gástrico, um processo evolutivamente conservado cujo papel preciso é mal compreendido. Este artigo descreve melhorias no protocolo atual usado para avaliar a acidificação do intestino melanogaster drosophila adulto e demonstra que pode ser usado em outras espécies de moscas. Em particular, este artigo demonstra que a acidificação intestinal depende do estado nutricional da mosca e apresenta um protocolo baseado neste novo achado. No geral, este protocolo demonstra a utilidade potencial de estudar células de cobre de Drosophila para descobrir princípios gerais subjacentes aos mecanismos de acidificação intestinal.

Introduction

No intestino do inseto, as células de cobre compartilham semelhanças celulares e funcionais com as células parietal gástricas produtoras de ácido (também conhecidas como oxíntica) do estômago mamífero. Este grupo de células libera ácido no lúmen intestinal. A função da secreção ácida e da anatomia é evolutivamente conservada. Os principais componentes do ácido descarregado são o ácido clorídrico e o cloreto de potássio. O mecanismo químico da formação de ácido nas células depende da anidrádrase carbônica. Esta enzima gera um íon bicarbonato de _CO2 e água, que libera um íon hidroxyl que é então descarregado no lúmen através de uma bomba de prótons em troca de potássio. Os íons de cloreto e potássio são transportados para o lúmen por canais de condutância que resultam na formação de ácido clorídrico e cloreto de potássio, principal componente do suco gástrico1,2,3,4.

Embora os mecanismos de formação de ácido sejam bem compreendidos, muito menos se sabe sobre os mecanismos fisiológicos que regulam a secreção ácida. O objetivo do desenvolvimento deste método é ajudar a delinear melhor as vias celulares que coordenam a formação e secreção de ácidos e determinar o papel do ácido na mediação da fisiologia intestinal e da homeostase. A lógica por trás do desenvolvimento e uso dessa técnica é fornecer um método consistente e confiável para estudar o processo de acidificação intestinal em Drosophila e organismos não-modelo. Embora exista atualmente um protocolo padrão para determinar a acidificação de drosophila midgut, atualmente existe ^2,5,6, observou-se variabilidade significativa na extensão da acidificação em moscas do tipo selvagem (TG) ao usar este protocolo para estudar a função celular de cobre. Para compreender a base dessa variabilidade observada e obter resultados consistentes, vários aspectos do protocolo padrão foram otimizados conforme descrito abaixo.

Protocol

NOTA: A linha de laboratório padrão Oregon R foi usada como controle WT. Todas as moscas foram criadas em meio padrão de fubá-melaço (contendo melaço, ágar, levedura, farinha de milho, tegosept, ácido propiônico e água) em temperatura ambiente com 12/12 h de ritmo circadiano claro/escuro. 1. Preparando-se para o ensaio Coletar moscas fêmeas (0-2 dias de idade, não virgem) sob anestesia de CO2 e permitir que elas se recuperem em alimentos padrã…

Representative Results

Passamos fome de moscas do Oregon R por mais de 20 h e depois alimentamos-as com BPB (2%) por ~12 h, como descrito anteriormente7,8,9,10,11. Bromophenol blue (BPB) é um corante de pH. Ele muda de amarelo em pH 3.0 para azul em pH 4.6 ou superior. Após dissecção intestinal, como relatado anteriormente, algumas moscas foram encontradas para produzir ácido c…

Discussion

Um passo crítico neste protocolo é a dissecação adequada do intestino para visualizar a CCR para o fenótipo de acidificação. O ácido liberado das células de cobre está confinado à CCR quando o intestino está intacto. No entanto, durante a dissecção, o vazamento causado pela ruptura do intestino pode levar à difusão de ácido da CCR e resultar em um intestino erroneamente marcado como negativo para acidificação. Além disso, a cor amarela indicativa de acidificação desaparece dentro de 5-10 minutos ap?…

Materials

Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification