Monitoreo de la acidificación intestinal en el intestino adulto de Drosophila

Summary

Aquí, presentamos un protocolo estandarizado para monitorear la acidificación intestinal en Drosophila melanogaster con un rendimiento óptimo. Primero usamos este protocolo para el monitoreo de la acidificación intestinal en Drosophila melanogaster y luego demostramos su uso en especies de Drosophila no modelo.

Abstract

El intestino medio de la mosca de la fruta consta de múltiples regiones, cada una de las cuales está compuesta por células que llevan a cabo funciones fisiológicas únicas requeridas para el correcto funcionamiento del intestino. Una de estas regiones, la región de células de cobre (CCR), se localiza en el intestino medio y consiste, en parte, en un grupo de células conocidas como células de cobre. Las células de cobre están involucradas en la secreción de ácido gástrico, un proceso evolutivamente conservado cuyo papel preciso es poco conocido. Este artículo describe las mejoras en el protocolo actual utilizado para el ensayo de la acidificación del intestino adulto de Drosophila melanogaster y demuestra que se puede utilizar en otras especies de moscas. En particular, este trabajo demuestra que la acidificación intestinal depende del estado nutricional de la mosca y presenta un protocolo basado en este nuevo hallazgo. En general, este protocolo demuestra la utilidad potencial del estudio de las células de cobre de Drosophila para descubrir los principios generales que subyacen a los mecanismos de acidificación intestinal.

Introduction

En el intestino del insecto, las células de cobre comparten similitudes celulares y funcionales con las células parietales gástricas productoras de ácido (también conocidas como oxínticas) del estómago de los mamíferos. Este grupo de células libera ácido en la luz intestinal. La función de la secreción ácida y la anatomía se conserva evolutivamente. Los componentes principales del ácido descargado son el ácido clorhídrico y el cloruro de potasio. El mecanismo químico de la formación de ácido en las células depende de la anhidrasa carbónica. Esta enzima genera un ion bicarbonato a partir de _CO2 y agua, que libera un ion hidroxilo que luego se descarga en la luz a través de una bomba de protones a cambio de potasio. Los iones cloruro y potasio son transportados a la luz por canales de conductancia que resultan en la formación de ácido clorhídrico y cloruro de potasio, el componente principal del jugo gástrico1,2,3,4.

Aunque los mecanismos de formación de ácido son bien conocidos, se sabe mucho menos sobre los mecanismos fisiológicos que regulan la secreción de ácido. El objetivo de desarrollar este método es ayudar a delinear mejor las vías celulares que coordinan la formación y secreción de ácido y determinar el papel del ácido en la mediación de la fisiología intestinal y la homeostasis. La razón detrás del desarrollo y uso de esta técnica es proporcionar un método consistente y confiable para estudiar el proceso de acidificación intestinal en Drosophila y organismos no modelo. Aunque actualmente existe un protocolo estándar para determinar la acidificación del intestino medio de Drosophila2,5,6, se observó una variabilidad significativa en el grado de acidificación en moscas de tipo salvaje (WT) mientras se utilizaba este protocolo para estudiar la función de las células de cobre. Para comprender la base de esta variabilidad observada y obtener resultados consistentes, se optimizaron varios aspectos del protocolo estándar como se describe a continuación.

Protocol

NOTA: La línea de laboratorio estándar Oregon R se utilizó como control WT. Todas las moscas se criaron en medio estándar de harina de maíz-melaza (que contiene melaza, agar, levadura, harina de maíz, tegosept, ácido propiónico y agua) a temperatura ambiente con ritmo circadiano claro / oscuro de 12/12 h. 1. Preparación para el ensayo Recolecte moscas hembras (0-2 días de edad, no vírgenes) bajo anestesia de CO2 y permita que se recuperen con al…

Representative Results

Matamos de hambre a las moscas hembra de Oregon R durante más de 20 h y luego las alimentamos con alimentos suplementados con BPB (2%) durante ~ 12 h, como se describió anteriormente7,8,9,10,11. El azul de bromofenol (BPB) es un colorante sensible al pH. Cambia de amarillo a pH 3.0 a azul a pH 4.6 y superior. Después de la disección intestinal, como se inf…

Discussion

Un paso crítico en este protocolo es la disección adecuada del intestino para visualizar el CCR para el fenotipo de acidificación. El ácido liberado de las células de cobre se limita al CCR cuando el intestino está intacto. Sin embargo, durante la disección, la fuga causada por la ruptura del intestino puede conducir a la difusión de ácido del CCR y dar lugar a un intestino erróneamente calificado como negativo para la acidificación. Además, el color amarillo indicativo de acidificación se desvanece dentro d…

Materials

Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification