Overvågning af tarmforsuring i den voksne drosophila tarm

Summary

Her præsenterer vi en standardiseret protokol til overvågning af tarmforsuring i Drosophila melanogaster med optimal effekt. Vi bruger først denne protokol til overvågning af tarmforsuring i Drosophila melanogaster og demonstrerer derefter dens anvendelse i ikke-model Drosophila arter.

Abstract

Bananfluen midgut består af flere regioner, som hver især består af celler, der udfører unikke fysiologiske funktioner, der kræves for at tarmen fungerer korrekt. En sådan region, kobbercelleregionen (CCR), er lokaliseret til den midterste midttarm og består delvist af en gruppe celler kendt som kobberceller. Kobberceller er involveret i mavesyresekretion, en evolutionært bevaret proces, hvis præcise rolle er dårligt forstået. Dette papir beskriver forbedringer i den nuværende protokol, der bruges til at analysere for forsuring af den voksne Drosophila melanogaster tarm og viser, at den kan bruges på andre arter af fluer. Dette papir viser især, at tarmforsuring er afhængig af fluens ernæringsstatus og præsenterer en protokol baseret på dette nye fund. Samlet set viser denne protokol den potentielle nytte af at studere Drosophila kobberceller for at afdække generelle principper, der ligger til grund for mekanismerne for tarmforsuring.

Introduction

I insekttarmen deler kobberceller cellulære og funktionelle ligheder med de syreproducerende gastriske parietale celler (også kendt som oxyntiske) i pattedyrs mave. Denne gruppe af celler frigiver syre i tarmens lumen. Funktionen af syresekretion og anatomi bevares evolutionært. Hovedkomponenterne i den udledte syre er saltsyre og kaliumchlorid. Den kemiske mekanisme for syredannelse i cellerne afhænger af kulsyreanhydrase. Dette enzym genererer en bicarbonation fra _CO2 og vand, som frigiver en hydroxylion, der derefter udledes i lumen gennem en protonpumpe i bytte for kalium. Chlorid- og kaliumioner transporteres ind i lumen ved hjælp af konduktanskanaler, hvilket resulterer i dannelse af saltsyre og kaliumchlorid, hovedbestanddelen af mavesaft1,2,3,4.

Selvom mekanismerne for syredannelse er godt forstået, er der meget mindre kendt om de fysiologiske mekanismer, der regulerer syresekretion. Målet med at udvikle denne metode er at hjælpe med bedre at afgrænse de cellulære veje, der koordinerer syredannelse og sekretion og bestemme syrens rolle i formidlen af tarmfysiologi og homeostase. Rationalet bag udviklingen og anvendelsen af denne teknik er at tilvejebringe en konsekvent og pålidelig metode til at studere processen med tarmforsuring i Drosophila og ikke-modelorganismer. Selvom der i øjeblikket findes en standardprotokol til bestemmelse af Drosophila midgut forsuring2,5,6, blev der observeret signifikant variabilitet i omfanget af forsuring i vildtypefluer (WT), mens denne protokol blev brugt til at studere kobbercellefunktion. For at forstå grundlaget for denne observerede variabilitet og opnå konsistente resultater blev flere aspekter af standardprotokollen optimeret som beskrevet nedenfor.

Protocol

BEMÆRK: Standardlaboratorielinjen Oregon R blev brugt som WT-kontrol. Alle fluer blev opdrættet på standard majsmelasse-melasse medium (indeholdende melasse, agar, gær, majsmel, tegosept, propionsyre og vand) ved stuetemperatur med 12/12 timers lys / mørk døgnrytme. 1. Forberedelse til analysen Saml kvindelige fluer (0-2 dage gamle, ikke-jomfruelige) under CO2-anæstesi og lad dem komme sig på standard majsmel mad i mindst 3 dage før forsøg. …

Representative Results

Vi sultede Oregon R kvindelige fluer i mere end 20 timer og fodrede dem derefter med mad suppleret med BPB (2%) i ~ 12 timer, som beskrevet tidligere7,8,9,10,11. Bromphenolblå (BPB) er et pH-sensing farvestof. Det skifter fra gul ved pH 3,0 til blå ved pH 4,6 og derover. Efter tarmdissektion, som tidligere rapporteret, viste det sig, at nogle fluer producere…

Discussion

Et kritisk trin i denne protokol er den korrekte dissektion af tarmen for at visualisere CCR for forsuringsfænotypen. Syren frigivet fra kobbercellerne er begrænset til CCR, når tarmen er intakt. Under dissektion kan lækage forårsaget af brud på tarmen imidlertid føre til diffusion af syre fra CCR og resultere i en tarm, der fejlagtigt scores som en negativ til forsuring. Derudover falmer den gule farve, der indikerer forsuring, inden for 5-10 minutter efter dissektion, hvilket understreger vigtigheden af at score…

Materials

Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification