Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren
Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.
Abstract
Die zelluläre Heterogenität stellt das Verständnis der Funktion komplexer Gewebe auf Transkriptomebene vor Herausforderungen. Die Verwendung zelltypspezifischer RNAs vermeidet potenzielle Fallstricke, die durch die Heterogenität von Geweben verursacht werden, und löst die leistungsstarke Transkriptomanalyse aus. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) verwendet werden kann, um Ribosomen-gebundene RNAs aus einer kleinen Menge EGFP-exprimierender Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich für die Isolierung zelltypspezifischer RNAs mit dem kürzlich verfügbaren NuTRAP-Mausmodell und könnte auch verwendet werden, um RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen zu isolieren.
Introduction
Hochdurchsatzansätze, einschließlich RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und Microarray, haben es ermöglicht, Genexpressionsprofile auf genomweiter Ebene abzufragen. Für komplexe Gewebe wie Herz, Gehirn und Hoden liefern die zelltypspezifischen Daten mehr Details zum Vergleich der Verwendung von RNAs aus dem gesamten Gewebe 1,2,3. Um die Auswirkungen der zellulären Heterogenität zu überwinden, wurde seit Anfang der 2010er Jahre die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) entwickelt4. TRAP ist in der Lage, Ribosom-gebundene RNAs aus bestimmten Zelltypen ohne Gewebedissoziation zu isolieren. Diese Methode wurde für die Translatomanalyse (mRNAs, die zur Translation in das Ribosom rekrutiert werden) in verschiedenen Organismen verwendet, einschließlich der Ausrichtung auf eine extrem seltene Population von Muskelzellen in Drosophila-Embryonen5, der Untersuchung verschiedener Wurzelzellen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana6 und der Durchführung einer Transkriptomanalyse von Endothelzellen in Säugetieren7.
TRAP erfordert eine genetische Veränderung, um das Ribosom eines Modellorganismus zu markieren. Evan Rosen und Kollegen entwickelten kürzlich ein Mausmodell namens Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, das seit 2017 über das Jackson Laboratory erhältlich ist. Durch Kreuzung mit einer Cre-Mauslinie können Forscher dieses NuTRAP-Mausmodell verwenden, um Ribosomen-gebundene RNAs und Zellkerne aus Cre-exprimierenden Zellen ohne Zellsortierung zu isolieren. In Cre-exprimierenden Zellen, die auch das NuTRAP-Allel tragen, ermöglicht das EGFP/L10a-markierte Ribosom die Isolierung translatierender mRNAs unter Verwendung von Affinitäts-Pulldown-Assays. An derselben Zelle ermöglicht die Biotin-Ligase-Erkennungspeptid (BLRP)-markierte Kernmembran, die ebenfalls mCherry-positiv ist, die nukleare Isolierung durch affinitäts- oder fluoreszenzbasierte Reinigung. Das gleiche Forscherteam erzeugte auch eine ähnliche Mauslinie, in der die Kernmembran nur mit mCherry ohne Biotin8 markiert ist. Diese beiden genetisch veränderten Mauslinien ermöglichen die Charakterisierung gepaarter epigenomischer und transkriptomischer Profile bestimmter Zelltypen.
Der Hedgehog (Hh)-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Gewebeentwicklung9. GLI1, ein Mitglied der GLI-Familie, fungiert als transkriptioneller Aktivator und vermittelt die Hh-Signalisierung. Gli1+ Zellen können in vielen hormonsezernierenden Organen gefunden werden, einschließlich der Nebenniere und des Hodens. Um zelltypspezifische DNAs und RNAs aus Gli1+-Zellen mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren, wurden Gli1-CreERT2-Mäuse mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt. Shh-CreERT2-Mäuse wurden auch mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt, um Schalligel (Shh) exprimierende Zellen zu isolieren. Das folgende Protokoll zeigt, wie Gli1-CreERT2 verwendet wird. NuTRAP-Mäuse isolieren Ribosomen-gebundene RNAs aus Gli1+-Zellen in erwachsenen Maushoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Nützlichkeit der Ganzgewebe-Transkriptom-Analyse könnte gedämpft werden, insbesondere bei der Untersuchung komplexer heterogener Gewebe. Wie man zelltypspezifische RNAs erhält, wird zu einer dringenden Notwendigkeit, die leistungsstarke RNA-seq-Technik zu entfesseln. Die Isolierung zelltypspezifischer RNAs beruht in der Regel auf der Sammlung eines bestimmten Zelltyps mittels Mikromanipulation, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM)18. Andere …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von NIH R00HD082686 unterstützt. Wir danken dem Sommerforschungsstipendium der Endocrine Society an H.S.Z. Wir danken auch Dr. Yuan Kang für die Zucht und Pflege der Mauskolonie.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Riferimenti
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