सेल सॉर्टिंग के बिना स्नैप-जमे हुए विषम ऊतक नमूनों से सेल-टाइप-विशिष्ट आरएनए को अलग करें
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके राइबोसोमल एमआरएनए का अनुवाद करने वाले सेल-प्रकार-विशिष्ट को अलग करना है।
Abstract
सेलुलर विषमता एक प्रतिलेख स्तर पर जटिल ऊतकों के कार्य को समझने के लिए चुनौतियां पैदा करती है। सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए का उपयोग ऊतकों की विविधता के कारण होने वाले संभावित नुकसान से बचाता है और शक्तिशाली ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण को उजागर करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि सेल सॉर्टिंग के बिना एक जटिल ऊतक में ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा से राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने के लिए राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने के लिए ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (ट्रैप) विधि का उपयोग कैसे किया जाए। यह प्रोटोकॉल हाल ही में उपलब्ध न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए को अलग करने के लिए उपयुक्त है और इसका उपयोग किसी भी ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं से आरएनए को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) और माइक्रोएरे सहित उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण ने जीनोम-वाइड स्तर पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल से पूछताछ करना संभव बना दिया है। हृदय, मस्तिष्क और वृषण जैसे जटिल ऊतकों के लिए, सेल-प्रकार-विशिष्ट डेटा पूरे ऊतक 1,2,3 से आरएनए के उपयोग की तुलना में अधिक विवरण प्रदान करेगा। सेलुलर विषमता के प्रभाव को दूर करने के लिए, ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (ट्रैप) विधि 2010के दशक की शुरुआत से विकसित की गई है। ट्रैप ऊतक पृथक्करण के बिना विशिष्ट सेल प्रकारों से राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने में सक्षम है। इस विधि का उपयोग विभिन्न जीवों में ट्रांसलेटोम (एमआरएनए जिन्हें अनुवाद के लिए राइबोसोम में भर्ती किया जा रहा है) विश्लेषण के लिए किया गया है, जिसमें ड्रोसोफिला भ्रूण5 में मांसपेशियों की कोशिकाओं की एक अत्यंत दुर्लभ आबादी को लक्षित करना, मॉडल प्लांट एराबिडोप्सिस थैलियाना6 में विभिन्न जड़ कोशिकाओं का अध्ययन करना और स्तनधारियों में एंडोथेलियल कोशिकाओं का ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण करनाशामिल है।
ट्रैप को एक मॉडल जीव के राइबोसोम को टैग करने के लिए आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता होती है। इवान रोसेन और उनके सहयोगियों ने हाल ही में न्यूक्लियर टैगिंग एंड ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (न्यूटीआरएपी) माउस8 नामक एक माउस मॉडल विकसित किया है, जो 2017 से जैक्सन प्रयोगशाला के माध्यम से उपलब्ध है। क्रे माउस लाइन के साथ पार करके, शोधकर्ता सेल सॉर्टिंग के बिना क्रे-व्यक्त कोशिकाओं से राइबोसोम-बाध्य आरएनए और सेल नाभिक को अलग करने के लिए इस न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग कर सकते हैं। क्रे-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में जो न्यूट्रैप एलील भी ले जाते हैं, ईजीएफपी / एल 10 ए टैग किए गए राइबोसोम आत्मीयता पुलडाउन परख का उपयोग करके एमआरएनए का अनुवाद करने के अलगाव की अनुमति देता है। उसी सेल में, बायोटिन लिगेज रिकग्निशन पेप्टाइड (बीएलआरपी) -टैग परमाणु झिल्ली, जो एमचेरी पॉजिटिव भी है, आत्मीयता- या प्रतिदीप्ति-आधारित शुद्धिकरण का उपयोग करके परमाणु अलगाव की अनुमति देता है। उसी शोध टीम ने एक समान माउस लाइन भी उत्पन्न की जिसमें परमाणु झिल्ली को बायोटिन 8 के बिना केवल एमचेरी के साथ लेबल कियागया है। ये दो आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनें रुचि में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के युग्मित एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल को चिह्नित करने के लिए पहुंच प्रदान करती हैं।
हेजहोग (एचएच) सिग्नलिंग मार्ग ऊतक विकास में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। GLI1, GLI परिवार का एक सदस्य, एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर के रूप में कार्य करता है और एचएच सिग्नलिंग की मध्यस्थता करता है। ग्लि1+ कोशिकाएं कई हार्मोन-स्रावित अंगों में पाई जा सकती हैं, जिनमें अधिवृक्क ग्रंथि और वृषण शामिल हैं। न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके ग्लि1+ कोशिकाओं से सेल-प्रकार-विशिष्ट डीएनए और आरएनए को अलग करने के लिए, ग्लि1-सीआरईआरटी 2 चूहों को न्यूट्रैप चूहों के साथ पार किया गया था। एसएचएच-सीआरईआरटी 2 चूहों को भी न्यूट्रैप चूहों के साथ पार किया गया था, जिसका उद्देश्य सोनिक हेजहोग (एसएचएच) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को अलग करना था। निम्न प्रोटोकॉल दिखाता है कि Gli1-CreERT2 का उपयोग कैसे करें; वयस्क माउस वृषण में ग्लि1+ कोशिकाओं से राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने के लिए न्यूट्रैप चूहे।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूरे ऊतक ट्रांसक्रिपटम विश्लेषण की उपयोगिता को कम किया जा सकता है, खासकर जब जटिल विषम ऊतकों का अध्ययन किया जाता है। सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए कैसे प्राप्त करें, शक्तिशाली आरएनए-सेक तकनीक को उजागर करने ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंशिक रूप से एनआईएच आर 00एचडी082686 द्वारा समर्थित था। हम एचएसजेड के लिए एंडोक्राइन सोसाइटी समर रिसर्च फैलोशिप का धन्यवाद करते हैं। हम माउस कॉलोनी के प्रजनन और रखरखाव के लिए डॉ युआन कांग को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Riferimenti
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