Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare
Summary
Questo protocollo mira a isolare mRNA ribosomiali traslatori specifici per tipo cellulare utilizzando il modello murino NuTRAP.
Abstract
L’eterogeneità cellulare pone sfide alla comprensione della funzione dei tessuti complessi a livello di trascrittoma. L’uso di RNA specifici del tipo di cellula evita potenziali insidie causate dall’eterogeneità dei tessuti e scatena la potente analisi del trascrittoma. Il protocollo qui descritto dimostra come utilizzare il metodo TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) per isolare gli RNA legati al ribosoma da una piccola quantità di cellule che esprimono EGFP in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Questo protocollo è adatto per isolare RNA specifici del tipo di cellula utilizzando il modello murino NuTRAP recentemente disponibile e potrebbe anche essere utilizzato per isolare gli RNA da qualsiasi cellula che esprime EGFP.
Introduction
Gli approcci ad alto rendimento, tra cui il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) e il microarray, hanno reso possibile interrogare i profili di espressione genica a livello dell’intero genoma. Per tessuti complessi come cuore, cervello e testicolo, i dati specifici del tipo di cellula forniranno maggiori dettagli confrontando l’uso di RNA dall’intero tessuto 1,2,3. Per superare l’impatto dell’eterogeneità cellulare, il metodo Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) è stato sviluppato fin dai primi anni 20104. TRAP è in grado di isolare RNA legati al ribosoma da specifici tipi di cellule senza dissociazione tissutale. Questo metodo è stato utilizzato per l’analisi del translatoma (mRNA che vengono reclutati nel ribosoma per la traduzione) in diversi organismi, incluso il targeting di una popolazione estremamente rara di cellule muscolari negli embrioni di Drosophila5, lo studio di diverse cellule radicali nella pianta modello Arabidopsis thaliana6 e l’esecuzione dell’analisi del trascrittoma delle cellule endoteliali nei mammiferi7.
La TRAP richiede una modificazione genetica per marcare il ribosoma di un organismo modello. Evan Rosen e colleghi hanno recentemente sviluppato un modello murino chiamato Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, che è disponibile attraverso il Jackson Laboratory dal 2017. Incrociando con una linea murina Cre, i ricercatori possono utilizzare questo modello murino NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma e i nuclei cellulari dalle cellule che esprimono Cre senza ordinamento cellulare. Nelle cellule che esprimono Cre, che trasportano anche l’allele NuTRAP , il ribosoma marcato EGFP/L10a consente l’isolamento degli mRNA traduttori mediante saggi di pulldown di affinità. Nella stessa cellula, la membrana nucleare marcata con peptide di riconoscimento della biotina ligasi (BLRP), che è anche mCherry positiva, consente l’isolamento nucleare utilizzando la purificazione basata sull’affinità o sulla fluorescenza. Lo stesso team di ricerca ha anche generato una linea di topi simile in cui la membrana nucleare è etichettata solo con mCherry senza biotina8. Queste due linee di topi geneticamente modificati danno accesso alla caratterizzazione di profili epigenomici e trascrittomici accoppiati di specifici tipi di cellule in interesse.
La via di segnalazione del riccio (Hh) svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo dei tessuti9. GLI1, un membro della famiglia GLI, agisce come attivatore trascrizionale e media la segnalazione Hh. Le cellule Gli1+ possono essere trovate in molti organi secernenti ormoni, tra cui la ghiandola surrenale e il testicolo. Per isolare DNA e RNA specifici del tipo di cellula dalle cellule Gli1+ utilizzando il modello murino NuTRAP, i topi Gli1-CreERT2 sono stati incrociati con i topi NuTRAP. I topi Shh-CreERT2 sono stati anche incrociati con i topi NuTRAP per isolare le cellule che esprimono il riccio sonico (Shh). Il seguente protocollo mostra come utilizzare Gli1-CreERT2; Topi NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma dalle cellule Gli1+ nei testicoli di topo adulto.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilità dell’analisi del trascrittoma dell’intero tessuto potrebbe essere smorzata, specialmente quando si studiano tessuti eterogenei complessi. Come ottenere RNA specifici del tipo di cellula diventa una necessità urgente per scatenare la potente tecnica RNA-seq. L’isolamento degli RNA specifici del tipo di cellula di solito si basa sulla raccolta di un tipo specifico di cellule mediante micromanipolazione, selezione cellulare attivata da fluorescente (FACS) o microdissezione a cattura laser (LCM)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente supportato da NIH R00HD082686. Ringraziamo la Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Ringraziamo anche il Dr. Yuan Kang per aver allevato e mantenuto la colonia di topi.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Riferimenti
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
