細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語)
Summary
このプロトコルは、NuTRAPマウスモデルを使用して細胞型特異的翻訳リボソームmRNAを単離することを目的としています。
Abstract
細胞の不均一性は、トランスクリプトームレベルで複雑な組織の機能を理解する上で課題をもたらします。細胞種特異的RNAを使用することで、組織の不均一性によって引き起こされる潜在的な落とし穴を回避し、強力なトランスクリプトーム解析を解き放ちます。ここで説明するプロトコルは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法を使用して、細胞を選別することなく、複雑な組織内の少量のEGFP発現細胞からリボソーム結合RNAを単離する方法を示しています。このプロトコルは、最近入手可能な NuTRAP マウスモデルを使用して細胞タイプ特異的RNAを単離するのに適しており、EGFP発現細胞からRNAを単離するためにも使用できます。
Introduction
RNAシーケンシング(RNA-seq)やマイクロアレイなどのハイスループットアプローチにより、ゲノムワイドレベルで遺伝子発現プロファイルを調べることが可能になりました。心臓、脳、精巣などの複雑な組織の場合、細胞タイプ固有のデータは、組織全体からのRNAの使用を比較する詳細を提供します1、2、3。細胞の不均一性の影響を克服するために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法が2010年代初頭から開発されてきました4。TRAPは、組織を解離することなく、特定の細胞タイプからリボソーム結合RNAを単離することができます。この方法は、ショウジョウバエ胚5の非常にまれな筋細胞集団の標的化、モデル植物シロイヌナズナ6のさまざまな根細胞の研究、哺乳類7の内皮細胞のトランスクリプトーム解析など、さまざまな生物のトランスラトーム(翻訳のためにリボソームにリクルートされるmRNA)分析に使用されています。
TRAPは、モデル生物のリボソームにタグを付けるための遺伝子改変を必要とする。今回、Evan Rosenたちの研究グループは最近、核タグ付けと翻訳リボソーム親和性精製(NuTRAP)マウス8と呼ばれるマウスモデルを開発したが、これは2017年からジャクソン研究所で入手できる。Creマウス株と交配することにより、研究者はこの NuTRAP マウスモデルを使用して、細胞を選別することなく、Cre発現細胞からリボソーム結合RNAおよび細胞核を単離することができます。 NuTRAP 対立遺伝子も持つCre発現細胞では、EGFP/L10aタグ付きリボソームにより、アフィニティープルダウンアッセイを使用して翻訳mRNAを単離できます。同じ細胞では、ビオチンリガーゼ認識ペプチド(BLRP)タグ付き核膜(これもmCherry陽性)であり、アフィニティーまたは蛍光ベースの精製を使用して核分離を可能にします。同じ研究チームはまた、核膜がビオチン8なしでmCherryのみで標識される同様のマウス系統を生成しました。これらの2つの遺伝子改変マウス株は、関心のある特定のタイプの細胞のペアのエピゲノムおよびトランスクリプトミクスプロファイルを特徴付けるためのアクセスを提供します。
ハリネズミ(Hh)シグナル伝達経路は、組織発生において重要な役割を果たします9。GLIファミリーのメンバーであるGLI1は、転写活性化因子として作用し、Hhシグナル伝達を媒介します。Gli1+細胞は、副腎や精巣を含む多くのホルモン分泌器官に見られます。NuTRAPマウスモデルを用いてGli1+細胞から細胞型特異的DNAおよびRNAを単離するために、Gli1-CreERT2マウスをNuTRAPマウスと交配した。Shh−CreERT2マウスはまた、音波ハリネズミ(Shh)発現細胞を単離することを目的としたNuTRAPマウスと交配した。次のプロトコルは、Gli1-CreERT2を使用する方法を示しています。NuTRAPマウスは、成体マウス精巣中のGli1+細胞からリボソーム結合RNAを単離します。
Protocol
Representative Results
Discussion
全組織トランスクリプトーム解析の有用性は、特に複雑な不均一組織を研究する場合、損なわれる可能性があります。細胞種特異的RNAをいかに入手するかは、強力なRNA-seq技術を解き放つための緊急の必要性となっています。細胞種特異的RNAの単離は、通常、マイクロマニピュレーション、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を用いた?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH R00HD082686によって部分的にサポートされていました。内分泌学会サマーリサーチフェローシップのH.S.Zに感謝します。また、マウスのコロニーの繁殖と維持について、Yuan Kang博士にも感謝します。
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Riferimenti
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