Questo protocollo mira a isolare mRNA ribosomiali traslatori specifici per tipo cellulare utilizzando il modello murino NuTRAP.
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Articolo metodologico
Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'eterogeneità cellulare pone sfide alla comprensione della funzione dei tessuti complessi a livello di trascrittoma. L'uso di RNA specifici del tipo di cellula evita potenziali insidie causate dall'eterogeneità dei tessuti e scatena la potente analisi del trascrittoma. Il protocollo qui descritto dimostra come utilizzare il metodo TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) per isolare gli RNA legati al ribosoma da una piccola quantità di cellule che esprimono EGFP in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Questo protocollo è adatto per isolare RNA specifici del tipo di cellula utilizzando il modello murino NuTRAP recentemente disponibile e potrebbe anche essere utilizzato per isolare gli RNA da qualsiasi cellula che esprime EGFP.
Introduzione
Gli approcci ad alto rendimento, tra cui il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) e il microarray, hanno reso possibile interrogare i profili di espressione genica a livello dell'intero genoma. Per tessuti complessi come cuore, cervello e testicolo, i dati specifici del tipo di cellula forniranno maggiori dettagli confrontando l'uso di RNA dall'intero tessuto 1,2,3. Per superare l'impatto dell'eterogeneità cellulare, il metodo Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) è stato sviluppato fin dai primi anni 20104. TRAP è in grado di isolare RNA legat....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti hanno seguito i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) dell'Università di Auburn.
NOTA: Il seguente protocollo utilizza un testicolo (circa 100 mg) a P28 da Gli1-CreERT2; Topi NuTRAP (Mus musculus). Potrebbe essere necessario regolare i volumi dei reagenti in base ai tipi di campioni e al numero di tessuti.
1. Raccolta dei tessuti
- Eutanasia i topi usando una camera CO2 , disinfettare la superficie dell'addome con etanolo al 70%.
- Aprire l'addome inferiore....
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Risultati
Il topo Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) è stato prima incrociato con il topo reporter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) per generare topi a doppio mutante. I topi portatori di entrambi gli alleli genici geneticamente modificati (cioè Gli1-CreERT2 e NuTRAP) sono stati iniettati con tamoxifene una volta al giorno, a giorni alterni, per tre iniezioni. I campioni di tessuto sono stati raccolti il 7 ° giorno dopo il 1° giorno dell'i.......
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Discussione
L'utilità dell'analisi del trascrittoma dell'intero tessuto potrebbe essere smorzata, specialmente quando si studiano tessuti eterogenei complessi. Come ottenere RNA specifici del tipo di cellula diventa una necessità urgente per scatenare la potente tecnica RNA-seq. L'isolamento degli RNA specifici del tipo di cellula di solito si basa sulla raccolta di un tipo specifico di cellule mediante micromanipolazione, selezione cellulare attivata da fluorescente (FACS) o microdissezione a cattura laser (LCM)18.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente supportato da NIH R00HD082686. Ringraziamo la Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Ringraziamo anche il Dr. Yuan Kang per aver allevato e mantenuto la colonia di topi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Actb | eurofins | primer qPCR | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTTTT (primer diretto/primer inverso) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cicloesimmide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | primer qPCR | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (primer diretto/primer inverso) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Ditiotreitolo | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnete | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Provette Falcon 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP anticorpo | Abcam | ab290 | |
| Set di smerigliatrici per vetro | DWK Life Sciences | 357542 | |
| eparina | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| em>Hsd3b | eurofins | primer qPCR | GACAGGAGCAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (primer diretto/primer inverso) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Provette per microcentrifuga 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Microarray per test Clariom S di topo | Thermo Fisher Scientific | Servizio di microarray | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Kit | dell'RNA | |
| PicoPure | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Cellule di crescita | in acqua senza RNasi | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Inibitore ribonucleasico ricombinante | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | primer qPCR | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (primer diretto/primer inverso |
| Superscript IV trascrittasi inversa | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | primer | qPCRGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (innesco avanti/innesco inverso) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Riferimenti
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al.
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Ristampe e permessi
