Выделение специфических для клеток РНК из замороженных образцов гетерогенных тканей без сортировки клеток
Summary
Этот протокол направлен на изоляцию специфических для клеточного типа транслирующих рибосомных мРНК с использованием мышиной модели NuTRAP.
Abstract
Клеточная гетерогенность создает проблемы для понимания функции сложных тканей на уровне транскриптома. Использование специфических для клеточного типа РНК позволяет избежать потенциальных ловушек, вызванных неоднородностью тканей, и высвобождает мощный анализ транскриптома. Протокол, описанный здесь, демонстрирует, как использовать метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP) для выделения рибосомно-связанных РНК из небольшого количества EGFP-экспрессирующих клеток в сложной ткани без сортировки клеток. Этот протокол подходит для выделения специфических для клеток РНК с использованием недавно доступной мышиной модели NuTRAP , а также может быть использован для выделения РНК из любых EGFP-экспрессирующих клеток.
Introduction
Высокопроизводительные подходы, включая секвенирование РНК (RNA-seq) и микрочипы, позволили исследовать профили экспрессии генов на уровне всего генома. Для сложных тканей, таких как сердце, мозг и яичко, специфические для клеточного типа данные предоставят более подробную информацию, сравнивающую использование РНК из всей ткани 1,2,3. Чтобы преодолеть влияние клеточной гетерогенности, с начала 2010-х годов был разработан метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP)4. TRAP способен изолировать рибосомно-связанные РНК из определенных типов клеток без диссоциации тканей. Этот метод был использован для анализа транслейлома (мРНК, которые набираются в рибосому для трансляции) в различных организмах, включая нацеливание на чрезвычайно редкую популяцию мышечных клеток в эмбрионах дрозофилы5, изучение различных корневых клеток в модельном растении Arabidopsis thaliana6 и выполнение транскриптомного анализа эндотелиальных клеток у млекопитающих7.
TRAP требует генетической модификации для маркировки рибосомы модельного организма. Эван Розен и его коллеги недавно разработали модель мыши под названием Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, которая доступна через Лабораторию Джексона с 2017 года. Пересекаясь с линией мыши Cre, исследователи могут использовать эту модель мыши NuTRAP для выделения рибосомных РНК и клеточных ядер из Cre-экспрессирующих клеток без сортировки клеток. В cre-экспрессирующих клетках, которые также несут аллель NuTRAP , рибосома с меткой EGFP / L10a позволяет изолировать транслирующие мРНК с использованием аффинных вытягивающих анализов. В той же клетке ядерная мембрана, помеченная пептидом распознавания биотин-лигазы (BLRP), которая также является mCherry положительной, позволяет ядерную изоляцию с использованием аффинной или флуоресцентной очистки. Та же исследовательская группа также создала аналогичную линию мышей, в которой ядерная мембрана помечена только mCherry без биотина8. Эти две генетически модифицированные линии мыши дают доступ к характеристике парных эпигеномных и транскриптомных профилей конкретных типов клеток, представляющих интерес.
Сигнальный путь ежа (Hh) играет решающую роль в развитии тканей9. GLI1, член семейства GLI, действует как транскрипционный активатор и опосредует передачу сигналов Hh. Клетки Gli1+ можно найти во многих гормон-секретирующих органах, включая надпочечники и яичко. Чтобы изолировать специфические для клеток ДНК и РНК из клеток Gli1+ с использованием мышиной модели NuTRAP , мышей Gli1-CreERT2 скрещивали с мышами NuTRAP . Мышей Shh-CreERT2 также скрещивали с мышами NuTRAP с целью выделения клеток, экспрессирующих звукового ежа (Shh). Следующий протокол показывает, как использовать Gli1-CreERT2; Мыши NuTRAP для выделения рибосомно-связанных РНК из клеток Gli1+ во взрослых мышах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Полезность анализа транскриптома всей ткани может быть ослаблена, особенно при изучении сложных гетерогенных тканей. Как получить специфические для клеток РНК становится насущной необходимостью для высвобождения мощной техники РНК-seq. Выделение специфических для клеток РНК обычно о?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана NIH R00HD082686. Мы благодарим Летнюю исследовательскую стипендию Эндокринного общества H.S.Z. Мы также благодарим доктора Юань Кана за разведение и поддержание колонии мышей.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Riferimenti
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
