ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر بروتوكول حقن اليرقة
Summary
تم استخدام ذباب ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة على نطاق واسع ككائنات حية نموذجية للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للميكروبات المضيفة واستراتيجيات العدوى الميكروبية. لتعزيز مرحلة يرقة D. melanogaster كنظام نموذج إضافي أو بديل ، يتم وصف تقنية حقن اليرقات.
Abstract
يوفر استخدام النماذج غير التقليدية لدراسة المناعة الفطرية وضراوة مسببات الأمراض بديلا قيما لنماذج الثدييات ، والتي يمكن أن تكون مكلفة وتثير قضايا أخلاقية. النماذج غير التقليدية رخيصة الثمن ، وسهلة التعامل معها وثقافتها ، ولا تأخذ مساحة كبيرة. فهي قابلة للتعديل وراثيا وتمتلك تسلسلات جينوم كاملة ، ولا يمثل استخدامها أي اعتبارات أخلاقية. على سبيل المثال ، قدمت ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر رؤى رائعة في مجموعة متنوعة من أبحاث السلوك والتنمية والتمثيل الغذائي والمناعة. وبشكل أكثر تحديدا ، تمتلك الذباب واليرقات البالغة D. melanogaster العديد من ردود الفعل الدفاعية الفطرية التي يتم مشاركتها مع الحيوانات الفقارية. تم الكشف عن الآليات التي تنظم الاستجابات المناعية في الغالب من خلال الدراسات الجينية والجزيئية في نموذج D. melanogaster. هنا يتم توفير تقنية جديدة لحقن اليرقات ، والتي ستعزز التحقيقات في العمليات المناعية الفطرية في يرقات D. melanogaster واستكشاف التسبب في مجموعة واسعة من الالتهابات الميكروبية.
Introduction
تم استخدام ذبابة الفاكهة بشكل كبير في البحوث البيولوجية والطبية الحيوية لعدة عقود ، حيث تطورت المجموعة المتطورة من الأدوات الوراثية والجزيئية بشكل مطرد لتحليل مجموعة واسعة من الدراسات 1،2،3،4. جعلت جوانب التنمية والتوازن والمناعة الفطرية المحفوظة تطوريا في D. melanogaster من كائن حي نموذجي قيم لدراسة مختلف الأمراض البشرية والحشرية5,6. ومن الجدير بالذكر أن الدور الأساسي لنموذج D. melanogaster لدراسة المناعة قد تجسد إلى حد كبير في دراسات الذباب البالغ. ومع ذلك ، ساهمت دراسات يرقات D. melanogaster أيضا في المعرفة الحالية واستكشفت بشكل رئيسي الاستجابات المناعية الخلوية ، وتحديدا لعدوى والديدان الخيطية التي تحدث من خلال بشرة الحشرات7،8،9،10. تمتلك يرقات ذبابة الفاكهة ثلاثة أنواع مختلفة من خلايا الدم ، تسمى مجتمعة خلايا الدم: خلايا البلازما ، والخلايا البلورية ، والخلايا الصفائحية 11،12،13. يمكن لهذه الخلايا تركيب مجموعة من الاستجابات المناعية عندما تصاب يرقات D. melanogaster بمسببات الأمراض مثل البكتيريا والفطريات والفيروسات والطفيليات14،15،16. تشمل الاستجابات المناعية الخلوية الابتلاع المباشر (البلعمة) للجزيئات الصغيرة أو البكتيريا ، والميلانين ، وتغليف مسببات الأمراض الأكبر مثل البيض الطفيلي ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وسينثاز أكسيد النيتريك (NOS) 17،18،19.
في المقابل ، تم نشر عدد أقل من الدراسات حول استخدام نموذج يرقات D. melanogaster لتحليل الاستجابات المناعية الخلطية. ويرجع ذلك أساسا إلى تطبيق مقايسات التغذية للعدوى الفموية ليرقات D. melanogaster والعديد من التحديات المرتبطة باليرقات المجهرية بما في ذلك المعالجة الدقيقة لليرقات والاستخدام السليم للإبرة الدقيقة ، خاصة أثناء الاختراق20,21. وبالتالي، فإن المعرفة المحدودة بعدوى اليرقات والصعوبات التقنية (أي ارتفاع معدل الوفيات) جعلت من الصعب استخدام نموذج يرقات D. melanogaster. سيكون لنموذج اليرقات القدرة على تحديد آليات جزيئية جديدة من شأنها أن توفر المزيد من الأفكار حول التفاعلات بين المضيف والممرض وتحريض استجابات مناعية فطرية محددة للمضيف ضد العدوى المسببة للأمراض.
هنا يتم وصف بروتوكول بسيط وفعال يمكن استخدامه لحقن يرقات D. melanogaster مع مسببات الأمراض المختلفة ، مثل البكتيريا ، بالتفصيل. على وجه الخصوص ، تستخدم يرقات D. melanogaster للحقن مع مسببات الأمراض البشرية Photorhabdus asymbiotica والبكتيريا غير المسببة للأمراض Escherichia coli. يمكن استخدام هذه الطريقة للتلاعب وتحليل الاستجابات المناعية ل D. melanogaster لمختلف الالتهابات الميكروبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر من بين النماذج الأكثر قيمة والتي تم التلاعب بها تجريبيا والمستخدمة في التحقيقات في المناعة الفطرية والتسبب في العدوى الميكروبية المختلفة. ويرجع ذلك إلى دورة حياتها البسيطة والسريعة ، والصيانة البسيطة في المختبر ، وعلم الوراثة التطوري الراسخ ، وصندو?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء قسم العلوم البيولوجية في جامعة جورج واشنطن (GWU) على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم GT من خلال زمالة Harlan الصيفية من GWU. تم إجراء جميع الأشكال الرسومية باستخدام BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
Riferimenti
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetica. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
