Summary
I denne protokol beskriver vi, hvordan man injicerer musens fosterhule ved E7.5 med lentivirus, hvilket fører til ensartet transduktion af hele neuralpladen med minimale skadelige virkninger på overlevelse eller embryonal udvikling.
Abstract
Manipulation af genekspression i den udviklende musehjerne i utero har et stort potentiale for funktionelle genetikstudier. Det har dog tidligere stort set været begrænset til manipulation af embryonale stadier efter neurulation. En protokol blev udviklet til at injicere fosterhulen ved embryonal dag (E) 7.5 og levere lentivirus, kodning af cDNA eller shRNA, rettet mod >95% af neurale plade- og neurale kamceller, hvilket bidrager til den fremtidige hjerne, rygmarv og perifere nervesystem. Denne protokol beskriver de trin, der er nødvendige for at opnå en vellykket transduktion, herunder slibning af glaskapillærnåle, graviditetsverifikation, udviklingsmæssig iscenesættelse ved hjælp af ultralydsbilleddannelse og optimale injektionsvolumener matchet med embryonale stadier.
Efter denne protokol er det muligt at opnå transduktion af >95% af den udviklende hjerne med højtiter lentivirus og dermed udføre genmanipulation i hele hjernen. I modsætning hertil er det muligt at opnå mosaiktransduktion ved hjælp af lavere virale titere, hvilket giver mulighed for genetisk screening eller afstamningssporing. Injektion ved E7.5 er også rettet mod ektoderm og neural crest, der bidrager til forskellige rum i øjet, tungen og det perifere nervesystem. Denne teknik giver således mulighed for at manipulere genekspression i mus neurale plade- og ektodermafledte væv fra præneurulationsstadier med den fordel at reducere antallet af mus, der anvendes i forsøg.
Introduction
Hjernen og rygmarven er blandt de første organer, der initierer dannelse under embryogenese 1,2. Selvom generne forbundet med neuroudviklingsforstyrrelser identificeres, har den funktionelle undersøgelse af genetiske varianter haltet bagefter 3,4. Da dannelsen af betingede knockout-mus kan tage måneder eller år, er en alternativ teknik til hurtigt at undersøge genfunktionen i den udviklende hjerne af interesse. I museembryoner forekommer neurulation - den morfogenetiske proces, hvorved neuralpladen omdannes til neuralrøret for at give anledning til centralnervesystemet (CNS) - mellem dag 8 og 10 efter undfangelse5. Før neurulationen begynder, består neuralpladen som en del af ektodermen af et enkelt lag søjleceller, der vil sprede sig og differentiere sig i de mange neuronale og gliacelletyper inden for CNS 6,7. For eksperimentelt at fremkalde langvarige ændringer af genekspression i CNS giver målretning mod den neurale plade derfor indlysende fordele, herunder tilgængeligheden af alle stamceller.
Inden for neurovidenskab erder i ovo-elektroporation 8,9 og viral transduktion af museembryoner blevet brugt til at manipulere embryonal CNS-genekspression. Det udviklende kyllingembryo har været en valgmodel til undersøgelse af genfunktion under rygmarvsudvikling på grund af tilgængeligheden af kyllingembryoet i ægget og den deraf følgende lette manipulation af genekspression. Især i ovoplasmid genererer elektroporation eksperimentelle og kontrolbetingelser i hver kylling rygmarv. Elektroporation forårsager cellemembranpermeabilisering og leder negativt ladet DNA væk fra den (negative) katode mod den (positive) anode ved at anvende en elektrisk puls via to elektroder på embryoet. Hos mus har in utero elektroporation generelt været begrænset til embryonale stadier, hvor neurulation er afsluttet, og hjernen eller rygmarven består allerede af flere cellelag, hvilket resulterer i lav elektroporationseffektivitet10. Plasmidelektroporation resulterer i forbigående genekspression og er generelt rettet mod få celler.
Ultralyd-guidet i utero mikroinjektion er blevet brugt til at manipulere forskellige embryonale strukturer såsom hud og hjerne11,12,13,14. Imidlertid har injektioner rettet mod den udviklende murine CNS vist lav effekt eller har negativt påvirket embryonal overlevelse12,13,14. Derfor blev der udviklet en forbedret protokol til levering af højtiter lentivirus i fosterhulen (AC) ved E7.5, som blev døbt NEPTUNE for neural plate targeting med in uteronano-injection15. Injektioner resulterede i en langvarig målretningseffekt på >95% af hele hjernen ved E13.5. Desuden blev der introduceret et iscenesættelsestrin under ultralydsverifikation af graviditet for at sortere kvinder og graviditeter efter udviklingsstadium for at minimere unødvendige procedurer på forsøgsdyr og maksimere injektionssucces. Injektionseffektivitet og overlevelse er tæt forbundet med stigningen i AC-størrelse. Derfor beskriver dette papir, hvordan man måler AC-størrelse før injektion for at levere et passende volumen til AC, der ikke vil forårsage resorption af embryoet. NEPTUN er et robust alternativ til nuværende in utero-tilgange og kan tilpasses til flere anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, gain and loss of function-studier, afstamningssporing eller screening15,16.
Protocol
CD1 vildtype mus blev opstaldet i henhold til europæiske regler, med en standard dag og nat cyklus med mad og vand ad libitum. CD1-hunner blev parret med CD1-hanner natten over, og vaginale plugs blev kontrolleret om morgenen (E0.3). Kun gravide kvinder blev brugt til injektionen. Etisk godkendelse af alle eksperimenter, der er beskrevet her, blev givet af den svenske landbrugsstyrelse (Jordbruksverket).
1. Forberedelse af glasnåle: nåletræk og slibning
BEMÆRK: Selvom formalede nåle kan købes, giver træknåle internt mulighed for nem justering af nålelængde, boring og skråvinkel.
- Monter en glaskapillær i mikropipetten / kapillærtrækkeren. Brug følgende indstillinger ved hjælp af det angivne udstyr (se materialetabellen): varme 580 enheder; hastighed 140 enheder; tid 200 enheder; tryk 500-800 enheder.
BEMÆRK: Enhederne med forskellige parametre defineres af kapillærtrækkeren. Enheder kan variere for forskelligt udstyr. - Tryk på Træk for at trække kapillæren fra hinanden, hvilket giver to glaskapillærer med tilspidsede ender.
BEMÆRK: Efter træk smeltes spidserne af de to glaskapillærer sammen på grund af mikropipettettrækkerens høje temperatur. - Klip spidsen med kirurgisk saks for at opnå en nålelængde på ~ 7 mm (målt fra hvor nålen begynder at tilspidses) (figur 1A).
BEMÆRK: For E7.5-injektioner er en lang og fin nål kritisk, da injektionsområdet er meget lille og delikat. Korte og bredborede nåle vil resultere i embryonale dødsfald. - Slib den afskårne nålespids for at skabe en skarp skråning (figur 1C-F).
- Slib nålen i en vinkel på 20° ved maksimal hastighed i mindst 30-45 min.
BEMÆRK: Ultrarent vand tilsættes til slibepladen for at fungere som smøremiddel, reducere friktion / temperatur og vaske glaspartikler væk (figur 1B). Overskydende væske kan dog bremse kværnen. - Sørg for, at kanylespidsen (figur 1C) berører slibepladens overflade (figur 1D), men ikke bøjes (figur 1E).
BEMÆRK: Bentslibning resulterer i en lang og skrøbelig nålespids med en forkert skråvinkel, som let kan gå i stykker under injektionen. Brudnåle kan skade embryoet og skal erstattes med en intakt nål. En korrekt jordspids er vist i figur 1F,G. Efter slibning forventes den resulterende nåleboring at have en indvendig diameter (ID) på ~ 15 μm og en udvendig diameter (OD) på ~ 35 μm (figur 1G).
- Slib nålen i en vinkel på 20° ved maksimal hastighed i mindst 30-45 min.
- Fyld en 1 ml sprøjte med mineralolie og fastgør en 27 G nål.
- Fjern kanylehætten, og sæt sprøjtenålen i den nymalede glaskapillær. Injicer mineralolie, indtil olien drypper fra kapillærspidsen. Bliv ved med at injicere, mens du trækker 27 G-nålen ud, indtil kapillærnålen er fyldt med mineralolie, hvorefter sprøjtenålen kan fjernes.
- Opbevar jord- og mineraloliefyldte nåle i et lukket miljø for at forhindre skader og støvophobning. Til opbevaring indsættes to ruller modellervoks i en almindelig petriskål for at tjene som holdere (figur 1H). Sæt forsigtigt nålene på leret og placer dem langt fra hinanden for nem hentning af nålene.
BEMÆRK: Da nåleforberedelse er tidskrævende, er det bedst at forberede nåle mindst en dag før injektioner. Kassér nålene efter maksimalt to kuld, da de bliver stumpe. Forbered altid reservenåle i tilfælde af nåleskader under forberedelse eller injektion.
Figur 1: Nåleforberedelse til E7.5 fosterhuleinjektioner. (A) Repræsentative eksempler på en trukket, men uskåret glaskapillærnål (til venstre), en kapillærnål skåret i den optimale længde til E7.5-injektioner (midten) og en kapillærskæring for kort (højre). (B) Kværnen med ensartet dækning af vand, som er klar til nåleslibning. (C-F) Repræsentative eksempler på forskellige nålespidser. (C) Klippet, men umalet nålespids monteret i kværn; (D) ideel slibeposition med nålespidsen, der bare rører kværnen; E) nålen sænkes for langt og bøjes under formalingsprocessen (F) en ideel malet nålespids til E7.5 AC-injektioner. (G) En malet nålespids, der viser boringen med en indvendig diameter på ~15 μm og en udvendig diameter på ~35 μm, som er egnet til E7.5 AC-injektion. Nåleboringen er vist som stiplede linjer. Ydre diameter betegnet med røde pilespidser; indvendig diameter betegnet med blå pilespidser. (H) Nåleopbevaring: Petriskål fyldt med trukne og malede nåle. To rækker modellervoks tjener som holdere. BEMÆRK: For det okulære mikrometer i C, F, G er 1 cm opdelt i 100 pladser; målet er 3x; derfor 1 tonehøjde = 10.000 μm/(100 × 3) ≈ 33,4 μm. Forkortelser: AC = fosterhulrum; ID = indvendig diameter; OD = ydre diameter. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Dag før injektion: forbered bænk til ultralydsverifikation af graviditet
BEMÆRK: Alt arbejde skal udføres i en ventileret Biosafety Level 2 (BSL 2) bænk, når du arbejder med lentivirus. Ultralydsverifikation af graviditet kan udføres på en ventileret bænk.
- Tænd for ultralydsmaskinen, varmebordet og O2-forsyningen til isofluranpumpen (kan variere mellem udstyr).
BEMÆRK: Kontroller isofluransystemet for at sikre, at der ikke siver isofluran ud i luften. - Placer en tom affaldspose (tapet til indervæggen for nem adgang), hårfjerningscreme, sterile pakkede vatpinde, vand, silkepapir og kirurgisk tape inde i BSL 2-bænken.
- Forbered fire stykker kirurgisk tape (~ 7 cm lang) for at sikre musens lemmer under ultralydskontrollen af graviditeten.
3. Ultralydskontrol for at bekræfte graviditet
BEMÆRK: Dette trin kan udføres dagen før E7.5-injektioner ved E6.5. Se diskussionen for detaljer om kontrollen for svangerskabsalder.
- Placer den tidsparrede hunmus i induktionskammeret.
- Tænd for gasstrømmen med en iltstrøm på ~ 2,1 LPM og en indledende dosis på 3-4% isofluran for at inducere anæstesi.
- Kontroller, at kvinden er fuldstændig bedøvet ved at kontrollere poterefleksen. Hvis poterefleksen er fraværende, skal du sænke isofluran til 1,5-2%.
BEMÆRK: Det tager ca. 3 minutter at fremkalde anæstesi. - Skift gasstrømmen fra induktionskammeret til varmebordets næsekegle.
- Placer den bedøvede kvinde i en liggende stilling (mave op) på varmebordet og læg snuden i den vedhæftede næsekegle for at sikre vedligeholdelse af anæstesi under ultralydskontrollen af graviditeten.
- Fastgør alle fire poter til bordet med de forberedte stykker kirurgisk tape uden at strække kvindens krop eller fange whiskers.
- Påfør en ærte-størrelse mængde hårfjerningscreme på underlivet. Brug en vatpind til at fordele cremen over underlivet (en ~ 3 x 3 cm firkant) og massér den forsigtigt ind ved at rulle vatpinden frem og tilbage.
- Når pelsen begynder at løsne sig fra huden, fugtes et silkepapir og fjerner cremen og pelsen. Rengør det affurede område med fugtigt silkepapir, indtil al creme og hår er væk. Tør huden.
- Påfør en blommeformet mængde ultralydsgel på det barberede område og fortsæt med at identificere livmoderen ved hjælp af ultralyd ved en af følgende tre tilgange.
- For at gøre dette manuelt skal du holde ultralydssonden i ultralydgelen og flytte sonden for at finde livmoderen.
- For semimanuel tilgang #1 skal du placere ultralydssonden (fastgjort til rækværkssystemet) over den kvindelige mave ved at løsne og flytte en del af skinnen langs x-planet. Sænk ultralydssonden ned i gelen (z-plan) og scan gennem underlivet (y-plan) (figur 2A).
- For semimanuel tilgang # 2, sænk ultralydssonden (fastgjort til rækværkssystemet) ind i gelen for at afbilde underlivet. Hold ultralydssonden stationær under processen, og flyt varmebordet med de påsatte hjul langs x og / eller y-planer (figur 2B).
BEMÆRK: På disse tidlige embryonale stadier kan indre organer, fx tarmen, ligne livmoderen i ultralydsbilleddannelse. Men mens embryoner og løvfælder fremstår som en sekvens af kugler (beslægtet med perler langs en halskæde), har tarmen udseende af et kontinuerligt rør. Forbindelsen mellem lysende rum (separate kugler vs. et kontinuerligt rør) kan vurderes ved at scanne frem og tilbage gennem strukturen af interesse for at afgøre, om strukturen er en diskret kugle (embryo / løvfældelse) (figur 2C) eller et kontinuerligt rør (tarm) (figur 2D). På dette stadium er det ikke nødvendigt at registrere antallet af embryoner; det er tilstrækkeligt at bekræfte deres tilstedeværelse eller fravær.
- Når graviditetsstatus er bestemt, skal du løfte ultralydssonden væk fra maven og tørre underlivet rent med fugtigt silkepapir for at fjerne ultralydgelen.
- Sluk for isofluranpumpen, og fjern det kirurgiske bånd for at frigøre poterne.
- Placer hunnen i den udsatte position (maven ned) i et rent bur på en 40 °C varmeplade. Hold kvinden under nøje observation, indtil hun genvinder bevidstheden, hvilket tager 2-6 min.
BEMÆRK: Sørg for, at ultralydskontrollen for en kvinde er <10 minutter for at minimere eksponeringen for isofluran. - Fjern alt materiale og affald og rengør alle overflader med 70% ethanol. Tør enhver resterende ultralydsgel af ultralydssonden med et tørt, blødt og fnugfrit papirvæv. Sluk for ultralydsmaskinen, ventileret bænk / BSL2 bænk, varmebord og O2 forsyning.
4. Ultralydskontrol for embryo iscenesættelse
BEMÆRK: Dette trin udføres før operationen og tjener til at stratificere de gravide kvinder i henhold til deres AC-størrelser. Dette trin er afgørende ved E7.5, når målet er at målrette mod den udviklende CNS. På dette tidlige udviklingsstadium påvirker en forskel på et par timer i udvikling signifikant størrelsen af AC og progressionen af neurulation.
- Bedøve den første gravide hunmus efter trinene i trin 3.1-3.5.
- Placer og fiksér kvinden på bordet som beskrevet i trin 3.6.
- Påfør en blommeformet mængde ultralydsgel på den barberede mave og sænk ultralydssonden for at afbilde kvindens underliv.
BEMÆRK: Dette trin antager, at kvinden blev inspiceret ved ultralyd den foregående dag for graviditet og allerede har fået fjernet pels på maven. Hvis dette ikke er tilfældet, skal pelsen fjernes inden tilsætning af ultralydsgel efter trin 3.7-3.8. Ved E7.5 er livmoderen og løvfælderne større og lettere at skelne fra indre organer. Derudover er AC større og kan skelnes fra det eksocelomiske hulrum (ExC). - Scan gennem venstre og højre livmoderhorn så fuldstændigt som muligt.
BEMÆRK: Nogle embryoner ligger dybere inde i kvindens krop og kan savnes. - Optag antallet og stadierne af embryonerne. Noter antallet af fosterhuler i ideel størrelse, acceptable hulrum og løvfælder uden hulrum (figur 2E-G).
- Iscenesæt alle graviditeterne og ranger dem i overensstemmelse hermed.
- Injicer hunner med et flertal af AC'er i ideel størrelse umiddelbart efter ultralydskontrollen (trin 4.4) ved at følge instruktionerne i trin 4.5-4.7.
- For kvinder med et flertal af acceptable (hvor de eksocelome og fosterhulrum endnu ikke er klart opdelt i to hulrum) eller fraværende hulrum, skal du udsætte injektionen og iscenesætte dem igen efter et par timer. Hvis de fleste hulrum stadig er for små, skal du udsætte injektionerne med 10-12 timer.
Figur 2: Inspektion og iscenesættelse af fostervand under ultralydskontrol. (A) Oversigt over skinnesystemet med vedhæftet ultralydssonde, nanoinjektor og varmebord. Ultralydssonden kan flyttes i x-, y- og z-planer for at opnå optimal tilpasning til den kvindelige mave eller AC'erne. (B) Varmebordet kan flyttes via to hjul i x- og / eller y-planer for at muliggøre præcis scanning og vurdering af AC'erne, mens ultralydssonden kan forblive statisk. (C) Repræsentative ultralydsbilleder af E6.5 løvfælder inde i den kvindelige mave under ultralydskontrol for at bekræfte graviditet (hvide stiplede konturer). Ingen hulrum er dannet på dette tidspunkt; Men nogle gange er ektoplacentalken (hvide stjerner) synlig. Løvfælder kan genkendes af deres sfæriske form og skelnes fra tarmen, der fremstår som et kontinuerligt rør. (D) Repræsentativ billedsekvens af tyndtarmen (hvidtede stiplede konturer), som er kontinuerlig i scanning gennem underlivet. (E-G) Repræsentative ultralydsbilleder under iscenesættelse af hulrum før E7.5-injektioner. De fostervands- og eksocelomiske hulrum er dannet og adskilles af amnionen. Den ektoplacentale kegle tjener som den vigtigste blodforsyning og fremstår som et lyspunkt i ultralydet. AC er mest distal fra ectoplacental kegle. (E) Ideelle AC'er ser ud til at være større end det eksokelome hulrum, mens mellemstore hulrum ser mindre ud (F). Hvis der ikke er synlige hulrum (G), betyder det enten, at embryoet er resorberet eller endnu ikke har nået E7.5. Skalastænger = 1 mm. Forkortelser: A = Amnion; AC = fostervand; ExC = eksocelomisk hulrum; EC = Ektoplacental kegle. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Injektionsdag: Forbered BSL2-bænken til operation
- Lim et stykke elastisk membran på den runde, centrale åbning af en kommercielt tilgængelig, modificeret petriskål. Sørg for, at membranen er godt fastgjort til petriskålen for at forhindre lækage.
BEMÆRK: Hvis fadet bliver utæt eller ikke er godt limet, kan kanterne på den elastiske membran fastgøres yderligere med gaffatape. - Lav et 1-1,5 cm langt snit i midten af den elastiske membran.
- Tænd for ultralydsmaskinen, BSL2-bænken, varmepladen, O2-forsyningen til isofluranpumpen og glasperlesterilisatoren (indstillet til 300 °C).
- Inde i BSL2-bænken skal du placere en tom affaldspose (tapet til indervæggen for nem adgang); sterile pakkede vatpinde (brug en ny til hver operation / hver kvinde); kirurgiske værktøjer (saks, pincet, klip, sutur) og kirurgisk tape; en hel flaske fosfatbufferet saltvand (PBS) ved stuetemperatur, en tom flaske til affaldsindsamling og en 25 ml pipette; en petriskål med elastisk membran til kirurgi; låget på petriskålen med et 2 x 2-3 x 3 cm stykke parafilm fastgjort til låget med en dråbe vand; modellervoks: 4 større kugler eller terninger (~ 3 x 3 x 3 cm3) og et cylindrisk stykke (~ 4 x 1 cm); en sprøjte med smertestillende middel (f.eks. buprenorfin, 0,05-0,1 mg/kg legemsvægt) og øjengelBEMÆRK: Kuglerne (eller terningerne) af modellervoks vil fungere som "fødder" eller stativer / holdere til petriskålen, når skålen er placeret oven på kvindens mave. Det cylindriske stykke ler fastgør embryonerne inde i skålen. Hvis der injiceres mere end én opløsning, eller nålen skal genopfyldes under injektioner, kan det samme stykke parafilm anvendes, hvis opløsningerne kan fordeles fra hinanden.
6. Nålebelastning
- Tør overskydende mineralolie af med silkepapir for et bedre greb.
BEMÆRK: Rengør altid væk fra spidsen for at forhindre skader eller personskade. - Sørg for, at alle komponenter (en tætnings O-ring, en afstandsstykke og en frontpakning - alle anbragt under spændetangen, figur 3A) er installeret i den korrekte retning (figur 3B, spændetang fjernet til visualisering) for at holde kapillærnålen på plads og skabe en lufttæt forbindelse, undgå bobledannelse, når du går frem eller trækker metalstemplet inde i nålen tilbage.
- Sørg for, at nanoinjektorens metalstempel er helt trukket tilbage. Bekræft ved at trykke på Fyld , og vent på et dobbeltbip, der angiver, at stemplet er trukket helt tilbage.
- Når spændetangen er fastgjort, men let løsnet (skruet 45-90 grader), skal du skubbe glasnålen på metalstemplet og skubbe kapillærnålen sammen med metalstemplet gennem den forreste pakning, indtil den når afstandsstykket (figur 3C, D, spændebånd fjernet til visualisering).
BEMÆRK: Der vises en vis modstand, når stemplet passerer gennem pakningen og falder, når det når afstandsstykket. Sørg for, at kapillærnålen er sat ordentligt ind i afstandsstykket for at skabe en lufttæt forbindelse (figur 3D). - Fastgør nålen ved at stramme nanoinjektorens spændebånd (skru sikkert på igen).
BEMÆRK: Stram ikke for meget, da dette kan knuse nålen. - Tryk på Tom for at skubbe stemplet ind i nålen og udvise olien fra kanylespidsen. Hvis glasnålen bevæger sig, skal du trække stemplet tilbage, fjerne nålen og genindlæse. Hvis dette får luftbobler til at dannes, skal du fjerne nålen og genopfylde med mineralolie.
BEMÆRK: En korrekt sikret nål bør ikke bevæge sig med stemplet. - Anbring en dråbe virus (~ 6 μL) eller en anden injektionsopløsning på et stykke parafilm1 (figur 3E; Evans blå farvestof bruges til visualiseringsformål).
BEMÆRK: Det maksimale volumen af nanoinjektoren er ~ 5 μL. - Tryk på Fyld for at oprette en luftboble, der skal fungere som skillevæg mellem olien og opløsningen (figur 3F).
BEMÆRK: Dette fungerer også som en positioneringsmarkør, når du fylder eller tømmer nålen. - Sænk nålen, nedsænk spidsen i opløsningen, og tryk på Fyld (figur 3F,G).
- Se væskeniveauet, når opløsningen belastes efter luftboblen. Tryk tom for at udvise tilstopningen og genindlæs ved at trykke på Fyld , hvis luftboblen bliver langstrakt, uden at væsken kommer ind i nålen. Hvis dette ikke løser problemet, skal du skifte nålen.
- Når nålen er fuldt lastet (figur 3H), løftes nålen i z-planet, og der suges et lille volumen luft ved spidsen for at forhindre fordampning af opløsningen ved nålespidsen og tilstopning af nålen.
- Drej nanoinjektoren med den fastgjorte nål væk fra operatøren mod bagsiden af bænken for at forhindre utilsigtet skade eller personskade.
Figur 3: Fastgørelse af nålen til nanoinjektoren og injektion af opløsningen. (A) Startposition, før nålen monteres på nanoinjektoren: metalstemplet trækkes helt tilbage, og spændebåndet fastgøres. (B) Under spændebåndet vises alle tre komponenter til fastholdelse og fastgørelse af nålen i korrekt rækkefølge (fra venstre mod højre): tætning af O-ring (tynd og sort), afstandsstykke (hvid), O-ring (sort) med stort hul (som nålen skal passere igennem). For at sikre en lufttæt forbindelse glider glasnålen over metalstemplet (C) og skubbes gennem åbningen af den forreste O-ring, indtil den når afstandsstykket (D). (E-H) Indlæsning af opløsningen i nålen. (E) En dråbe opløsning anbringes på et stykke parafilm på et pladelåg. (F) Skab en luftboble ved at trykke på Fyld, før opløsningen påsættes, og nedsænk kanylespidsen i opløsningen. (G) Opløsningen lægges i nålen. (H) Opløsningen lægges i nålen. BEMÆRK: Spændebåndet er fjernet i (B-D) til visualisering, men skal forblive fastgjort under eksperimenter. Det sidste trin i fastgørelsen af nålen er at stramme spændebåndet. Evans blå farvestof bruges til visualisering i E-H. Klik her for at se en større version af denne figur.
7. Injektioner
BEMÆRK: Alle instrumenter, der anvendes i denne procedure, steriliseres før operationen og mellem hver mus.
- Anæstetisere den første hun med hulrum i ideel størrelse (se punkt 4).
- Placer og fiksér kvinden på bordet, som beskrevet i trin 3.1-3.6.
- Påfør øjengel på øjnene for at forhindre hornhindeudtørring og injicer smertestillende subkutant.
BEMÆRK: Anbefalede analgetika: Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg legemsvægt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller lignende i overensstemmelse med lokale dyrevelfærdsbestemmelser. Multimodal perioperativ analgesi opretholdes med injicerede analgetika og isofluran. - Forbered underlivet aseptisk ved at tørre med en klud gennemblødt med 0,5 mg / ml chlorhexidinopløsning (eller lignende) og tør huden. Brug kirurgisk saks til at lave et 1,5-2,0 cm lodret midterlinje hudsnit i underlivet.
BEMÆRK: Forbered det kirurgiske område efter lokalt godkendte desinfektionsrutiner. - Løft huden forsigtigt og frigør huden fra det underliggende muskellag, ca. 1 cm omkring snitpunktet, for at lette suturering efter operationen.
- Lav et 1 cm lodret midterlinjesnit i muskellaget.
- Med et par tang skal du løfte den ene side af huden og muskellaget og med det andet par kigge efter livmoderhornene.
BEMÆRK: Løvfælderne er arrangeret som perler på en halskæde, mens tarmen er et langt, kontinuerligt rør (figur 4A). - Med tang skal du forsigtigt trække begge livmoderhorn ud af maven. Hold vævet mellem embryoner; klem dem ikke direkte (figur 4B).
BEMÆRK: Livmoderen er fastgjort til kroppen ved livmoderhalsen, og de to æggestokke / ovidukter er fastgjort via ledbånd. Træk ikke/løsn livmoderen fra disse ankerpunkter. - Tæl og noter antallet af embryoner på venstre og højre side.
- Nummer embryonerne enten fra æggestokken til livmoderhalsen eller fra livmoderhalsen til æggestokken.
BEMÆRK: Dette er især vigtigt, hvis injicerede embryoner vil blive indsamlet i embryonale stadier. - Med en fugtig vatpind skal du forsigtigt skubbe alle embryoner tilbage i bughulen, undtagen de første tre, der skal injiceres.
- Læg en dråbe PBS på elastikken i petriskålen og hold den umiddelbart over embryonerne.
- Indsæt lukkede tang i elastikkens snit og slip tangen for at åbne det elastiske snit, så væsken falder ned på embryonerne.
BEMÆRK: Dette sikrer rehydrering af embryonerne, og at den elastiske membran klæber til kvindens våde hud, hvilket forhindrer lækage af PBS i de næste trin. - Træk en del af livmoderen, svarende til tre embryoner, gennem elastikken med tang, og forsigtigt aborre petriskålen på kvindens mave.
- Med tangen og en fugtig vatpind justeres livmoderens placering og elastikken for at sikre, at elastikken er forseglet til kvindens hud for at forhindre PBS-lækage.
- Brug de fire lerfødder til at fastgøre og fastgøre petriskålen umiddelbart over maven, hvilket reducerer trykket på kvinden og følsomheden af billeddannelse over for kvindens vejrtrækning og hjerteslag.
- Tryk modelleringslercylinderen ned til højre for embryonerne/livmoderen for at fiksere livmoderen (figur 4C).
BEMÆRK: Denne orienteringsinstruktion forudsætter, at nålen er til venstre for kvinden, og at embryonerne i kvindens venstre livmoderhorn er udsat. Siden af livmoderen (venstre eller højre livmoderhorn) er afgørende, da AC enten vender mod nålen (venstre horn; Figur 4D) eller vender mod den stabiliserende lercylinder (højre horn; Figur 4E). - For at injicere embryoner fra højre livmoderhorn skal du placere lercylinderen på venstre side af embryonerne (figur 4F) og dreje varmebordet 180 ° (figur 4G) for at opnå den korrekte retning. Hvis nålen kan flyttes i stedet, skal du tilpasse efter behov til den relevante opsætning.
- Tilsæt PBS til petriskålen, indtil embryonerne og livmoderen er dækket af PBS.
- Sænk ultralydssonden i PBS, og juster musen / operationsbordet, så det første embryo er justeret med ultralydssonden for at lette optagelsen af injektionerne.
BEMÆRK: "Første" refererer til nummereringen af embryoner fra æggestokken til livmoderhalsen. - Scan gennem alle tre embryoner og inspicer AC'erne. Bestem injektionsvolumen som følger:
- Mål diameteren af AC med ultralydsmaskinen. Injicer 69 nL, hvis vekselstrømsdiameteren er ≤0,2 mm; injiceres 2 x 69 nL (= 138 nL), hvis vekselstrømsdiameteren er >0,2 mm og ≤0,29 mm; og injiceres 3 x 69 nL (= 207 nL), hvis vekselstrømsdiameteren > 0,29 mm (figur 4H).
BEMÆRK: Tidligere forsøg har vist, at op til 207 nL injektionsvolumener tolereres godt ved E7.515. Vellykkede injektioner med minimal indvirkning på overlevelsen opnås, når den relative volumenforøgelse af AC ikke overstiger 90%15. Variation i vekselstrømsstørrelse mellem kuldkammerater eller musestammer er almindelig og kan kræve yderligere optimering.
- Mål diameteren af AC med ultralydsmaskinen. Injicer 69 nL, hvis vekselstrømsdiameteren er ≤0,2 mm; injiceres 2 x 69 nL (= 138 nL), hvis vekselstrømsdiameteren er >0,2 mm og ≤0,29 mm; og injiceres 3 x 69 nL (= 207 nL), hvis vekselstrømsdiameteren > 0,29 mm (figur 4H).
- Indstil injektionsvolumenerne med injektionscontrolleren.
- Indstil injektionshastigheden til langsom med en injektionshastighed på 23 nL/s.
BEMÆRK: Forskellige udstyrsmodeller kan resultere i forskellige injektionskræfter. - Sænk nålen ned i PBS ved hjælp af hovedhjulene på skinnesystemet (x- og z-planer, figur 4I), og tryk på Tom på nanoinjektorstyringen, indtil væsken når nålespidsen.
BEMÆRK: Hvis nålen er tilstoppet, kan tryk på Tom opløse tilstoppet og / eller udvise tilstoppet. - Løft kanylen ud af PBS'en, og tryk på Inject. Kontroller, at en dråbe af det omtrentlige ønskede volumen aflades.
- Sænk nålen ned i PBS'en, og juster den med ultralydssonden og embryoet ved at flytte nanoinjektoren med y-planhjulet på mikromanipulatoren (figur 4J).
BEMÆRK: Nålespidsen er perfekt justeret, når den vises som et lyspunkt på ultralydsbilledet (figur 4K, L). Nålen kan flyttes i alle tre retningsplaner med mikromanipulatoren. - Juster nålevinklen med injektionsvinkelhjulet for at sikre en næsten vinkelret injektionsvinkel i forhold til livmodervæggen. Indsæt nålen i vekselstrøm i én bevægelse ved hjælp af injektionshjulet på mikromanipulatoren (figur 4J-M). Hold øje med nålespidsens lysstyrke. Hvis nålespidsen forsvinder fra ultralydsbilledet, skal du flytte ultralydssonden frem eller tilbage for at bringe nålen tilbage i fokus.
BEMÆRK: Når nålen er inde i vekselstrømmen, kan der foretages mindre ændringer af nålens position og fokus uden at skade embryoet (justeringer inden for ~ 0,3 mm). Juster ikke nålepositionen mere end dette. - Tryk på Injicer (for 207 nL skal du indstille lydstyrken til 69 nL og injicere tre gange). Efter injektion skal du vente i yderligere 5-10 sekunder, før du trækker nålen tilbage i en blid bevægelse.
Figur 4: Optimal størrelse og orientering af fosterhulen for vellykkede injektioner . (A) Uterin horn med flere E7.5 løvfælder, formet som en streng af kugler (nederst) sammenlignet med tyktarmen (øverst). (B) Tag fat i livmodervæv (hvide stiplede linjer) mellem løvfælder. Undgå at klemme løvfælderne (hvide pilespidser) direkte med tang, da løvfælder og udviklende embryoner er skrøbelige på dette tidlige stadium og tilbøjelige til resorption ved overdreven ekstern kraft. (C) Kvinde i liggende stilling med løvfælder blottet i en petriskål fyldt med PBS og monteret på fire fod modellervoks. Løvfælderne stabiliseres af et ekstra stykke modellervoks, formet som en cylinder. (D, E) Orientering af AC påvirkes af siden af livmoderhornet, der er udsat. Hvis der anvendes løvfælder fra venstre livmoderhorn, vil vekselstrømmen vende væk fra lerstabilisatoren og vil være let tilgængelig for nålen til venstre (D). Men hvis det højre livmoderhorn bruges, vil ektoplacentalkappen i stedet vende mod nålen, hvilket gør det vanskeligere at få adgang til AC (E). Derfor, når der injiceres i højre livmoderhorn, placeres lerstabilisatoren mod den nålevendte side (F), og hele varmebordet drejes 180 ° (G). (H) Anbefalede injektionsvolumener i henhold til AC-størrelser. Generelt kan hulrum med en diameter ≤ 0,2 mm injiceres med maksimalt 69 nL. Diametre > 0,2 mm og ≤ 0,29 mm tåler volumener op til 2 x 69 nL (138 nL), og hulrum > 0,29 mm kan injiceres med 3 x 69 nL (207 nL). Skalastænger = 1 mm. (I, J) Nanoinjektor er fastgjort til skinnesystemet og kan flyttes i x- og/eller z-planer. Nålens vinkel kan justeres med injektionsvinkelhjulet . (K, L) Nålespids (hvid pilespids) er justeret med vekselstrøm, når den vises lysest i ultralydet (L). (M) Ultralydsbillede, der viser injektionsprocessen, hvor nålespidsen er i vekselstrøm og godt justeret (hvid pilespids). Forkortelser: A = Amnion; AC = fostervand; ExC = eksocelomisk hulrum; EC = Ektoplacental kegle. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Flyt scenen til det næste embryo, og gentag trin 7.22-7.26 for de to andre embryoner, hvis de har passende AC-størrelser.
- Løft ultralydssonden og nålen ud af PBS ved hjælp af mikromanipulatoren. Drej nålen væk fra operatøren for at undgå skader og personskade.
- Med tang skal du lede 1. og 2. embryoner tilbage i kvindens underliv ved forsigtigt at skubbe dem gennem elastikken. Tag forsigtigt fat i vævet ved siden af det 3. embryo og træk livmoderen mod den øvre ende af det elastiske snit. Træk forsigtigt de 4.-6. embryoner op med tang og lad det 3. embryo komme ind i maven igen.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres uden at ændre PBS eller fjerne petriskålen. - Gentag efter behov, indtil alle embryoner med optimale AC'er er blevet injiceret, eller tidsfristen er nået.
- Skub forsigtigt embryonerne / livmoderen tilbage i kvindens underliv.
- Aspirer PBS og fjern petriskålen. Hvis der er brugt en virus, skal du håndtere som smitsomt affald.
- Sy det muskulære lag sammen med Vicryl (USP 6-0, nålelængde 13 mm, 3/8 cirkel) i enkle kontinuerlige eller afbrudte suturer og luk huden med 1-2 klip (se materialetabellen).
- Sluk for isofluranpumpen.
- Fjern operationsbåndet, og placer hunnen i den udsatte position (maven ned) i et rent bur på en 40 °C varmeplade.
BEMÆRK: Kvinden forventes at genvinde bevidstheden og være mobil inden for 10 min. Sørg for, at proceduren er afsluttet inden for 30 minutter. Den genetiske baggrund, alder og vægt af kvinden kan påvirke følsomheden over for anæstesi. Overvåg musene under operationen for tegn på langsom vejrtrækning (langsom vejrtrækning betyder, at anæstesi er for dyb) eller bevægelse (anæstesi er for let). Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg legemsvægt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller lignende i overensstemmelse med lokale dyrevelfærdsbestemmelser kan leveres 8 timer efter den første injektion, hvis det er nødvendigt. - Hvis en anden kvinde skal injiceres, skal du forberede det kirurgiske område, mens du overvåger opvågningen af den første.
- Tør de kirurgiske værktøjer af med 70% ethanol for at fjerne resterende blod eller væv og steriliser dem i den forvarmede glasperlesterilisator i 10 s. Kassér vatpindene og brugt silkepapir. Tør petriskålen og lerstykkerne tørre med silkepapir.
- Gentag trin 7.1-7.35, indtil alle kvinder er blevet injiceret.
- Tøm og kassér nålen.
- Hvis der er en virus eller injektionsopløsning tilbage i nålen, skal du trykke på Tøm på nanoinjektoren og tømme nålens indhold på silkepapir.
- Træk metalstemplet helt tilbage ved at trykke på Fyld , indtil der er et dobbeltbip fra controlleren, hvilket indikerer, at stemplet er helt trukket tilbage.
- Løsn spændebåndet, og skub nålen af metalstemplet. Kassér nålen i affaldsbeholderen med skarpe genstande.
- Rengør BSL-2 bænken.
- Hvis der blev brugt en virus, skal du sprøjte hele det kirurgiske felt med desinfektionsmiddel (se materialetabellen). Efter 15 minutter tørres desinfektionsmidlet af og hele det kirurgiske felt rengøres med 70% ethanol. Hvis der ikke blev brugt virus, skal du rengøre alle overflader med 70% ethanol.
- Tør eventuelt resterende PBS af ultralydssonden med tørt, blødt og fnugfrit silkepapir.
- Kassér affald i henhold til retningslinjerne for biosikkerhed.
- Sluk for ultralydsmaskinen, varmebordet, BSL2-bænken og O2-forsyningen .
Representative Results
Embryoner injiceret ved E7.5 med hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 blev indsamlet ved E13.5 og undersøgt under fluorescerende dissektionsmikroskop (figur 5A). Vellykket transduktion af neuralpladen resulterer i embryoner med stærk ekspression af en fluorescerende reporter i hjernen hovedsageligt og i andre ektodermafledte væv, fx huden (figur 5A, B). Injektion af et for højt volumen (større end de mængder, der anbefales her, f.eks. ≥500 nL) øger trykket i AC og kan resultere i enten fuldstændig resorption (data ikke vist) eller neuralrørsdefekter såsom exencephaly (figur 5A). Vellykkede injektioner ved E7.5 resulterer i ensartet transduktion fra forhjernen til baghjernen (figur 5C-J).
Lentivirale titere omkring 2 × 10 10 infektiøse enheder (IFU) opnår over 95% målretning, mens titre på ~ 1 ×10 9 IFU opnår 15% målretning effektivitet15. Derudover er strukturer, der tidligere har været vanskelige at målrette ved hjælp af elektroporation, såsom choroid plexus17,18, også målrettet (figur 5 E, F). Transduktionseffektivitet kan ændres ved at justere den virale titer, der leveres til AC. Injektioner af lav titer resulterer i transduktion af enkeltcellekloner (figur 5C, figur 5E og figur 5G, H), mens brug af højtitervirus transducerer næsten 100% af hele hjernen (figur 5D, figur 5F, figur 5H og figur 5J ). Derfor kan NEPTUNE bruges til enten klonal transduktion, afstamningssporing og genetiske screeningsmetoder eller studere de globale virkninger af genoverekspression eller nedregulering i hele hjernen.
Pattedyrs øjenudvikling er resultatet af velorganiseret kommunikation mellem tre derivater af embryonal ektoderm: den neurale nethinde (NR) og retinal pigmentepitel (RPE) er afledt af neuroepitelet i den ventrale forhjerne, mens overfladeektodermen giver anledning til det fremtidige linse- og hornhindeepitel. Imidlertid er den centrale stroma og det bageste endotel, de to andre lag af hornhinden, afledt af neurale kamceller i det periokulære mesenchyme19,20. Koronale sektioner gennem E13.5-embryoner, injiceret ved E7.5 med højtiterlentivirus, viste i lighed med hjernen høj og ensartet transduktion af øjets neurale væv såvel som linsen, hornhinden og mesenchymet (figur 5K). Efterhånden som neurulationen skrider frem, resulterer injektioner ved E8.5 og E9.5 i den fortsatte målretning af linse- og hornhindeepitelet (figur 5L og figur 5N), mens transduktion af øjets neuroektodermafledte væv er mindre effektiv ved E8.5 (figur 5L, M) eller ikke målrettet mod E9.5 (figur 5N).
Mens de fleste virale partikler inficerer det udsatte væv ved injektion, transducerer nogle partikler ikke-ektodermalt afledt væv, der udvikler sig senere (figur 6A). Spytkirtler og kanaler udvikler sig omkring E11.5 fra det orale epitel21 og er målrettet mod NEPTUN (figur 6B). Efter injektioner ved E9.5 transduceres tungens sproglige epitel godt; det underliggende mesenkym er imidlertid negativt (figur 6C; parenteser angiver transducerede celler; stjerner angiver autofluorescenssignal ikke transducerede celler). Derudover er der positive klynger inden for det sproglige epitel, adskilt af negative sektioner (figur 6C, hvide pilespidser), hvilket tyder på transduktion af papillaoverfladen. Neurale kamceller er beskrevet i det underliggende tungemesenkym og i det sproglige epitel, hvor de er involveret i udviklingen af smagspapiller og smagsløg22. Faktisk resulterer injektioner ved E7.5 i udbredt transduktion af tungemesenkymet ved E13.5 (figur 6D), hvilket tyder på, at tidlige injektioner er målrettet mod neurale kamceller, hvilket bidrager til mesenchym i tungen.
Hos hvirveldyr er dorsale rodganglier (DRG'er) en central komponent i det perifere nervesystem (PNS), da al somatosensorisk input fra kroppens periferi (temperatur, smerte, tryk) overføres til hjernen via aktivering af DRG-neuronerne23. Både neuroner og gliaceller i DRG er afledt af trunk neurale kamceller24. Lentiviral injektion, hvor den allestedsnærværende hPGK-promotor styrer ekspressionen af den fluorescerende reporter, fører til udbredt målretning af det centrale og perifere nervesystem (figur 7A), der transducerer både neuroner og forfædre i rygmarven (figur 7B) samt DRG (figur 7C). Brug af en MiniPromoter til doublecortin25 gør det muligt at begrænse GFP-ekspression til kun neuroner (15 og figur 7D, E).
Figur 5: Høj effektivitet eller klonal transduktion med NEPTUN. (A) E13.5-embryoner under et dissektionsmikroskop belyst med standardbelysning (venstre panel) og samme embryoner belyst til GFP (højre panel). Ikke-injiceret embryo yderst til venstre, med succes injiceret embryo yderst til højre, hvilket giver positivt signal i hjernen (embryo længst til højre). Exencephalic embryo på grund af overskydende volumen injiceret (mellemembryo). (B) Hud- og hjernemålretning med E7.5-injektion. Skalabjælke = 50 μm. (C, D) E13.5 konfokale billeder af forhjernen med lav klonal transduktion (C) eller højeffektiv transduktion (D). (C, E, G, I) Klonal transduktion af forskellige regioner i hjernen. (D, F, H, J) Højeffektiv transduktion af forskellige regioner i hjernen. Skala søjler = 200 μm. Forskellige transduktionseffektiviteter er repræsentative for andre områder af CNS. (E, F) Choroid Plexus målretning, klonalt (E) eller med høj effektivitet (F). Skalabjælker = 200 μm. (G, H) Klonal målretning (G) og højeffektiv (H) målretning af baghjerne, forstørret i (I, J). Skalabjælker = 200 μm. (K) GFP-reporterekspression i øjet ved E13,5 efter in utero-injektion ved E7,5 (L, M) GFP-reporterekspression i øjet ved E15,5 efter in utero-injektion ved E8,5 (L), boksområde forstørret i (M) eller ved E9,5 (N). Autofluorescerende blodkar er markeret med hvide stjerner. Skala søjler = 100 μm. Forkortelser: NEPTUN = neural plate targeting med in uteronano-injection; C = Hornhinde; LE = Linse epitel; LF = Linsefibre; M = Mesenchyme; NR = Neural nethinden; ON = Optisk nerve; RPE = retinal pigment epitel; GFP = grønt fluorescerende protein; CNS = centralnervesystemet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: In utero transduktion af ikke-neurale væv. (A) Konfokalbillede af E15.5 mundhule. Embryo blev injiceret med fluorescerende reporter lentivirus ved E9.5. Skala bar = 200 μm. (B, C) (B) Forstørrelse af indsat panel; spytkanalepitel transduceret med virus. (C) Forstørrelse af indsatspanel; dorsal lingual epitel transduceret med GFP reporter virus (hvid parentes). Det underliggende mesenkym afledt af neurale kamceller er negativt. Hvide pilespidser angiver papiller med negative neurale kamceller omgivet af virustransducerede epitelceller (autofluorescerende blodlegemer/kar er markeret med hvide stjerner). Skalabjælker = 50 μm. (D) Skematisk og konfokalt billede af E13,5 tungemesenkym efter injektioner med fluorescerende reportervirus ved E7.5. Skala bar = 50 μm. Forkortelser: D = Dorsal; M = Mesenchyme; N = Nasopharynx; SLD = sublingual kanal; SMD = submandibulær kanal; T = tunge; V = Ventral; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Transduktion af neurale crest-afledte dorsale rodganglionceller. (A) NEPTUN-målretning ved E7.5 tillader målretning af både CNS og PNS. (B) Konfokalbillede af E13.5 rygmarv og DRG'er injiceret med hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus ved E7.5 viser transduktion af både SOX2+ neurale forfædre og NeuN+ neuroner. Skalalinje = 100 μm. (C) Indrammet område af B, der viser DRG med GFP-udtryk i SOX2+ (hvide pile) og NeuN+ (hvide pilespidser) cellepopulationer. Skalabar = 20 μm. (D) Konfokalbillede af E13.5 rygmarv og DRG injiceret med DCX-H2B-GFP lentivirus ved E7.5, kun rettet mod DCX + celler. Skala bar = 100 μm. (E) Bokset område af D, der viser DRG med GFP-ekspression begrænset til DCX + neuroner (hvide pilespidser). DCX-celler er negative for GFP (hvide pile). Skala bar = 20 μm. Forkortelser: NEPTUN = neural plate targeting med in utero nano-injection; CNS = centralnervesystemet; PNS = perifert nervesystem; DRG'er = dorsale rodganglier; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Der er flere trin i denne protokol, der påvirker embryonal overlevelse, kvaliteten af injektionerne og udlæsningen. Embryoners svangerskabsalder defineres som E0.5 ved middagstid dagen for vaginalpluggen efter parring natten over. Udførelse af ultralydskontrol for graviditet ved E6.5 sent på eftermiddagen / aftenen sikrer, at embryonerne udvikles nok til at blive identificeret ved hjælp af ultralyd. Kontrollen (1) giver mulighed for præscreening af, hvor mange plug-positive mus der faktisk er gravide, (2) sikrer, at ingen virus optøes unødigt og spildes i tilfælde af, at plug-positive mus ikke er gravide, og (3) reducerer unødvendige indgreb på mus (undgår operation på ikke-gravide hunner).
Ved E7.5 er embryoner følsomme over for eksterne kræfter og skal håndteres med omhu. For eksempel kan trække i livmoderhornene eller klemme løvfælderne føre til embryoresorption. Livmodervævet skal altid holdes fugtigt, når det er uden for kvindens underliv for at forhindre vævet i at tørre. Størstedelen af løvfælderne skal forblive inde i den kvindelige mave, med kun 3-4 udsat for injektioner. Nåleskarphed er en anden afgørende determinant for vellykkede injektioner. Stumpe eller ødelagte nålespidser resulterer i gentagen stikning af løvfælder eller kompression mod modellervokseret, inden det kommer ind i AC, hvilket kan øge resorptionshastigheden. Derfor bør velmalede og skarpe nåle altid opbevares sikkert og udskiftes efter højst 2 hunner.
Denne protokol beskriver, hvordan man målretter den neurale plade med en enkelt injektion af lentivirus. Desuden viser det, hvordan transduktionseffektivitet kan tilpasses fra enkeltcellekloner til hele hjernen. Imidlertid er andre ikke-neurale væv, herunder huden og det orale epitel, også målrettet. Derudover transduceres alle celletyper (forfædre og differentierede celler), hvilket gør denne tilgang effektiv, men uspecifik. Anvendelsen af MiniPromoters i den virale konstruktion fører til den specifikke ekspression af transgenet i neuroner eller astrocytter15. Dette har den fordel, at man undgår brugen af dedikerede transgene Cre-dyr og reducerer derfor mængden af arbejdskraft (belastningsvedligeholdelse og genotypning) og omkostninger.
NEPTUN's begrænsninger omfatter dets tekniske vanskeligheder, udfordringer med at opnå gravide kvinder i en forudsigelig og konsekvent hastighed og omkostningerne ved at erhverve specialiseret instrumentering. Desuden kan ikke-selektiv målretning af celler med lentivirus ses som både en fordel og en begrænsning af teknikken. Injektion af større volumener i AC resulterer i exencephaly13, selvom hjernemisdannelser og exencephaly undgås med de mængder, der er beskrevet her15. En negativ indvirkning på hjernens udvikling er således en risiko med in utero nano-injektioner, der omhyggeligt skal undgås ved at injicere korrekte mængder tilpasset embryonale stadium og AC-størrelse.
Fremtidige tilpasninger af teknikken kan fokusere på viral tropisme. Adeno-associerede vira (AAV'er) har forskellige serotyper, som har vist sig at være robust målrettet mod forskellige celletyper i CNS17,26. AAV'er integreres imidlertid ikke i værtscellegenomet og kan derfor gå tabt i celler med en høj delingshastighed. Selvom der er flere måder at øge NEPTUNS specificitet på, er transgene dyr stadig guldstandarden, når det kommer til genmanipulation in vivo. Cas9-mus og sgRNA-kodende lentivirus er blevet brugt til genetisk screening i den embryonale epidermis27 og kan også tilpasses den udviklende CNS.
Injektioner i AC ved E7.5 målretter effektivt celler i neuroektodermen før initiering af neurulation og målretter den udviklende hjerne mere effektivt end i utero elektroporation. Dette gør det muligt at studere genetiske signaler, der er vigtige for hjernens udvikling fra et tidligere tidspunkt. I modsætning til klassiske genetiske musemodeller tilbyder NEPTUNE en fleksibel tilgang til at udføre funktionel genanalyse. Fænotyper efter overekspression eller gensletning kan undersøges inden for dage til uger sammenlignet med måneder eller år. Injektioner af flere virale konstruktioner giver mulighed for manipulation af flere gener i et embryo og undgår generering af dobbelt eller tredobbelt knockout dyr. Derfor sparer NEPTUNE ikke kun tid, men kan også reducere antallet af dyr, der anvendes i forskning.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Bettina Semsch og Jia Sun (Infinigene) for ekspertpleje af mus; Florian Salomons og Göran Månsson fra Biomedicum Imaging Core (BIC) for hjælp til billedoptagelse og konsultation. Finansiering: Vi takker følgende bidragydere for deres støtte til dette projekt: Det svenske forskningsråd, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID-finansiering og SFO StratNeuro-finansiering, Center of Innovative Medicine), Ollie og Elof Ericssons Foundation, Tornspiran Foundation, Jeansssons Foundation, Sven og Ebba-Christina Hagbergs Pris og forskningsbevilling, Knut og Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik og Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation og Swedish Foundations Starting Grant til ERA. Figur 4D,E blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD Bioscience | 309628 | |
| 27 G Needle | BD Bioscience | 300635 | |
| 3.5 inches capillaries | Drummond Scientific | 3000203G/X | Were used to pull in house needles |
| 70 MHz MS Series transducer | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic clear ultrasound gel | Parker Laboratories | Mar-50 | |
| Autoclip Applier 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1 mice | Charles River, Germany | Crl:CD1(ICR) | Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old |
| Cotton Swab | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Dressing forceps delicate straight 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EG-400 Narishige Micropipette Grinder | Narishige | NA | |
| EZ clips 9 mm | Angthos | 59027 | clips |
| Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| Isofluorane | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | Purchased from Swedish Pharmacy |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| Membrane Tape | Visual Sonics | SA-11053 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Modeling Clay | Sense AB | 10209 | |
| Mouse Handling Table | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II Auto Injector Kit | Drummond | 3-000-205A | |
| Parafilm | Bemis | HS234526C | |
| Petri dish with central opening (low wall) | Visual Sonics | SA-11620 | |
| Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | DuPont | 130000132037 | disinfectant |
| Silicone membrane | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250, hot bead sterilizer | Angthos | 31100 | |
| Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m) | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo Imaging Station 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament | Agnthos | J384H |
References
- Theiler, K. The House mouse. Atlas of embryonic development. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).
- Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).
- Taylor, J. C., et al. Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders. Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).
- Pizzo, L., et al. Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants. Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).
- Sakai, Y. Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure. The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).
- Schoenwolf, G. C. Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses. Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).
- Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate. Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).
- Slevin, J. C., et al. High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice. BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).
- Mangold, K., et al. Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE. Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).
- Kameneva, P., et al. Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin. Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).
- Heavner, W., Pevny, L.
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop. Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).
- Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds. Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).
- Marmigère, F., Ernfors, P. Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).
- Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).
- Portales-Casamar, E., et al. A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
