Modello di perforazione endovascolare per emorragia subaracnoidea combinata con risonanza magnetica (MRI)
Summary
Qui presentiamo un modello murino SAH standardizzato, indotto dalla perforazione del filamento endovascolare, combinato con la risonanza magnetica (MRI) 24 ore dopo l’operazione per garantire il corretto sito di sanguinamento ed escludere altre patologie intracraniche rilevanti.
Abstract
Il modello di perforazione del filamento endovascolare per imitare l’emorragia subaracnoidea (SAH) è un modello comunemente usato – tuttavia, la tecnica può causare un alto tasso di mortalità e un volume incontrollabile di SAH e altre complicanze intracraniche come ictus o emorragia intracranica. In questo protocollo viene presentato un modello murino SAH standardizzato, indotto dalla perforazione del filamento endovascolare, combinato con la risonanza magnetica (MRI) 24 ore dopo l’operazione per garantire il corretto sito di sanguinamento ed escludere altre patologie intracraniche rilevanti. In breve, i topi C57BL/ 6J vengono anestetizzati con un’iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina (70 mg/16 mg/kg di peso corporeo) e posti in posizione supina. Dopo l’incisione del collo della linea mediana, l’arteria carotide comune (CCA) e la biforcazione carotidea sono esposte e una sutura di polipropilene monofilamento non assorbibile 5-0 viene inserita in modo retrogrado nell’arteria carotide esterna (ECA) e avanzata nell’arteria carotide comune. Quindi, il filamento viene invaginato nell’arteria carotide interna (ICA) e spinto in avanti per perforare l’arteria cerebrale anteriore (ACA). Dopo il recupero dall’intervento chirurgico, i topi subiscono una risonanza magnetica 7.0 T 24 ore dopo. Il volume di sanguinamento può essere quantificato e classificato tramite risonanza magnetica postoperatoria, consentendo un robusto gruppo sperimentale SAH con la possibilità di eseguire ulteriori analisi di sottogruppo in base alla quantità di sangue.
Introduction
L’emorragia subaracnoidea (SAH) è causata dalla rottura di un aneurisma intracranico e rappresenta un’emergenza pericolosa per la vita, associata a morbilità e mortalità sostanziali, pari a circa il 5% degli ictus 1,2. I pazienti con SAH presentano forti mal di testa, disfunzioni neurologiche e disturbi progressivi della coscienza3. Circa il 30% dei pazienti con SAH muore entro i primi 30 giorni dopo l’evento emorragico iniziale4. Clinicamente, il 50% dei pazienti sperimenta lesioni cerebrali ritardate (DBI) dopo lesioni cerebrali precoci. La DBI è caratterizzata da ischemia cerebrale ritardata e deficit neurologici ritardati. Studi attuali hanno dimostrato che gli effetti sinergici di diversi fattori portano alla perdita della funzione neurologica, tra cui la distruzione della barriera emato-encefalica, la contrazione delle piccole arterie, la disfunzione microcircolatoria e la trombosi 5,6.
Un aspetto unico della SAH è che la patogenesi ha origine da una posizione extraparenchimale ma poi porta a cascate dannose all’interno del parenchima: la patologia inizia con l’accumulo di sangue nello spazio subaracnoideo, innescando una moltitudine di effetti intraparenchimali, come neuroinfiammazione, apoptosi delle cellule neuronali ed endoteliali, depolarizzazione della diffusione corticale e formazione di edema cerebrale7, 8.
La ricerca clinica è limitata da diversi fattori, rendendo il modello animale un elemento critico nell’imitare in modo coerente e accurato i cambiamenti patomeccanici della malattia. Sono stati proposti diversi protocolli modello SAH, ad esempio l’iniezione di sangue autologo nella cisterna magna (ACM). Inoltre, un metodo modificato con una doppia iniezione di sangue autologo nella cisterna magna e nella cisterna del chiasma ottico (APC) rispettivamente 9,10. Mentre l’iniezione di sangue autologo è un modo semplice per simulare il processo patologico del vasospasmo e le reazioni infiammatorie dopo l’emorragia subaracnoidea, il seguente aumento della pressione intracranica (ICP) è relativamente lento e non vengono indotti cambiamenti degni di nota nella permeabilità della barriera emato-encefalica11,12. Un altro metodo, il posizionamento del sangue periarterioso, solitamente utilizzato in grandi modelli di SAH (ad esempio, scimmie e cani), prevede il posizionamento di sangue autologo anticoagulato o di prodotti sanguigni comparabili attorno alla nave. I cambiamenti di diametro dell’arteria possono essere osservati con un microscopio, che funge da indicatore per il vasospasmo cerebrale dopo SAH13.
Barry et al. descrissero per la prima volta un modello di perforazione endovascolare nel 1979 in cui l’arteria basilare è esposta dopo aver rimosso il cranio; l’arteria viene quindi perforata con microelettrodi di tungsteno, utilizzando una tecnica stereotassica microscopica14. Nel 1995, Bederson e Veelken hanno modificato il modello Zea-Longa di ischemia cerebrale e stabilito la perforazione endovascolare, che è stata continuamente migliorata dal15,16. Questo metodo si basa sul fatto che topi e umani condividono una rete vascolare intracranica simile, nota come il cerchio di Willis.
Per la valutazione postoperatoria e la classificazione della SAH nel modello murino, sono stati proposti diversi approcci. Sugawara et al. hanno sviluppato una scala di classificazione che è stata ampiamente utilizzata dal 200817. Questo metodo valuta la gravità della SAH in base ai cambiamenti morfologici. Tuttavia, per questo metodo, la morfologia del tessuto cerebrale del topo deve essere esaminata in visione diretta e, pertanto, il topo deve essere sacrificato per la valutazione. Inoltre, sono stati stabiliti diversi metodi per determinare la gravità della SAH in vivo. Gli approcci vanno dal semplice punteggio neurologico al monitoraggio della pressione intracranica (ICP) a varie tecniche di imaging radiologico. Inoltre, la classificazione MRI si è dimostrata un nuovo strumento non invasivo per valutare la gravità del SAH, correlata al punteggio neurologico18,19.
Qui, viene presentato un protocollo per un modello SAH causato dalla perforazione endovascolare, combinato con la risonanza magnetica postoperatoria. Nel tentativo di stabilire un sistema per oggettivare la quantità di sanguinamento in un ambiente in vivo , abbiamo anche sviluppato un sistema per la classificazione SAH e la quantificazione del volume totale del sangue basato su una risonanza magnetica ponderata T2 ad alta risoluzione 7.0 T. Questo approccio garantisce la corretta induzione della SAH e l’esclusione di altre patologie come ictus, idrocefalo o emorragia intracerebrale (ICH) e complicanze.
Protocol
Representative Results
Discussion
In sintesi, un modello murino SAH standardizzato indotto dall’operazione di perforazione del filamento endovascolare è presentato con invasione minore, breve tempo operativo e tassi di mortalità accettabili. La risonanza magnetica viene condotta 24 ore su 24 postoperatoria per garantire il corretto sito di sanguinamento e l’esclusione di altre patologie intracraniche rilevanti. Inoltre, abbiamo classificato diversi gradi di sanguinamento SAH e misurato i volumi di sanguinamento, consentendo ulteriori analisi di sottogr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SL è stato sostenuto dal Chinese Scholarship Council. KT è stato sostenuto dalla borsa di studio BIH-MD dell’Istituto di sanità di Berlino e dalla Sonnenfeld-Stiftung. RX è supportato dal BIH-Charité Clinician Scientist Program, finanziato dalla Charité -Universitätsmedizin Berlin e dal Berlin Institute of Health. Riconosciamo il sostegno della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) e del Fondo di pubblicazione ad accesso aperto di Charité – Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
Riferimenti
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