Modelo de perfuração endovascular para hemorragia subaracnóide combinada com ressonância magnética (RM)
Summary
Aqui apresentamos um modelo padronizado de rato SAH, induzido pela perfuração de filamento endovascular, combinado com ressonância magnética (RM) 24 h após a operação para garantir o local correto do sangramento e excluir outras patologias intracranianas relevantes.
Abstract
O modelo de perfuração de filamento endovascular para imitar hemorragia subaracnóide (SAH) é um modelo comumente utilizado – no entanto, a técnica pode causar uma alta taxa de mortalidade, bem como um volume incontrolável de HAS e outras complicações intracranianas, como derrame ou hemorragia intracraniana. Neste protocolo, é apresentado um modelo padronizado de mouse SAH, induzido por perfuração de filamento endovascular, combinado com ressonância magnética (RM) 24 horas após a operação para garantir o local correto do sangramento e excluir outras patologias intracranianas relevantes. Resumidamente, os camundongos C57BL/6J são anestesiados com uma injeção de cetamina/xilazina intraperitoneal (70 mg/16 mg/kg de peso corporal) e colocados em uma posição supina. Após a incisão do pescoço médio, a artéria carótida comum (CCA) e a bifurcação carótida são expostas, e uma sutura de polipropileno monofilament não absorvível 5-0 é inserida de forma retrógrada na artéria carótida externa (ECA) e avançada na artéria carótida comum. Em seguida, o filamento é invagiado na artéria carótida interna (ICA) e empurrado para a frente para perfurar a artéria cerebral anterior (ACA). Após a recuperação da cirurgia, os camundongos passam por uma ressonância magnética 7.0 T 24 h depois. O volume de sangramento pode ser quantificado e classificado via ressonância magnética pós-operatória, permitindo um robusto grupo experimental sah com a opção de realizar novas análises de subgrupo com base na quantidade de sangue.
Introduction
A hemorragia subaracnóide (SAH) é causada pela ruptura de um aneurisma intracraniano e representa uma emergência com risco de vida, associada à morbidade e mortalidade substanciais, representando aproximadamente 5% dos derrames 1,2. Pacientes de HAS apresentam dores de cabeça severas, disfunção neurológica e perturbação progressiva da consciência3. Cerca de 30% dos pacientes da HAS morrem nos primeiros 30 dias após o evento inicialde sangramento 4. Clinicamente, 50% dos pacientes experimentam lesão cerebral retardada (DBI) após lesão cerebral precoce. O DBI é caracterizado por isquemia cerebral retardada e déficits neurológicos atrasados. Estudos atuais têm demonstrado que os efeitos sinérgicos de vários fatores diferentes levam à perda da função neurológica, incluindo a destruição da barreira hemencefálica, a contração de pequenas artérias, disfunção microcirculatória e trombose 5,6.
Um aspecto único da SAH é que a patogênese se origina de uma localização extraparenquiamal, mas leva a cascatas prejudiciais dentro do parenchyma: a patologia começa com o acúmulo de sangue no espaço subaracnóide, desencadeando uma infinidade de efeitos intraparenquiais, como neuroinflamação, apoptose celular neuronal e endotelial, despolarização cortical espalhando e formação de edema cerebral7, 8.
A pesquisa clínica é limitada por vários fatores, tornando o modelo animal um elemento crítico em imitar de forma consistente e precisa as mudanças pathomecanísticas da doença. Diferentes protocolos de modelo SAH foram propostos, por exemplo, injeção de sangue autóloga na cisterna magna (ACM). Além disso, um método modificado com dupla injeção de sangue autólogo na cisterna magna e cisterna quiasm óptica (APC) respectivamente 9,10. Embora a injeção de sangue autóloga seja uma maneira simples de simular o processo patológico do vasospasmo e reações inflamatórias após hemorragia subaracnóide, o aumento seguinte da pressão intracraniana (ICP) é relativamente lento, e nenhuma alteração notável na permeabilidade da barreira hematoencefálica é induzida11,12. Outro método, a colocação de sangue periarterial, geralmente usada em grandes modelos SAH (por exemplo, macacos e cães), envolve a colocação de sangue autólogo anticoagulante ou produtos sanguíneos comparáveis ao redor do vaso. As alterações de diâmetro da artéria podem ser observadas com um microscópio, servindo como indicador para o vasospasmo cerebral após a SAH13.
Barry et al. descreveram pela primeira vez um modelo de perfuração endovascular em 1979, no qual a artéria basilar é exposta após a remoção do crânio; a artéria é então perfurada com microeletrodos de tungstênio, usando uma técnica estereotática microscópica14. Em 1995, Bederson e Veelken modificaram o modelo Zea-Longa de isquemia cerebral e estabeleceram a perfuração endovascular, que tem sido continuamente melhorada desde15,16. Este método baseia-se no fato de que camundongos e humanos compartilham uma rede vascular intracraniana semelhante, conhecida como o círculo de Willis.
Para a avaliação pós-operatória e a classificação da SAH no modelo do mouse, foram propostas diferentes abordagens. Sugawara et al. desenvolveram uma escala de classificação que tem sido amplamente utilizada desde 200817. Este método avalia a gravidade da HAS com base em alterações morfológicas. No entanto, para este método, a morfologia do tecido cerebral do camundongo deve ser examinada sob visão direta e, portanto, o camundongo deve ser sacrificado para avaliação. Além disso, vários métodos para determinar a gravidade da HAS in vivo foram estabelecidos. As abordagens vão desde pontuação neurológica simples até monitoramento da pressão intracraniana (ICP) a várias técnicas de imagem radiológica. Além disso, a classificação da ressonância magnética tem sido mostrada como uma nova ferramenta não invasiva para classificar a gravidade da HAS, correlacionando-se com a pontuação neurológica18,19.
Aqui, é apresentado um protocolo para um modelo SAH causado pela perfuração endovascular, combinado com a ressonância magnética pós-operatória. Na tentativa de estabelecer um sistema para objetificar a quantidade de sangramento em um ambiente in vivo , também desenvolvemos um sistema para classificação e quantificação do volume sanguíneo total com base em ressonância magnética de alta resolução T2 de alta resolução de 7,0 T. Esta abordagem garante a indução correta da HAS e a exclusão de outras patologias como acidente vascular cerebral, hidrocefalia ou hemorragia intracerebral (ICH) e complicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em resumo, um modelo padronizado de mouse SAH induzido pela operação de perfuração de filamento endovascular é apresentado com pequena invasão, curto tempo operacional e taxas aceitáveis de mortalidade. A ressonância magnética é realizada 24h no pós-operatório para garantir o local correto do sangramento e a exclusão de outras patologias intracranianas relevantes. Além disso, classificamos diferentes graus de sangramento sah e medimos volumes sanguíneos, permitindo novas análises de subgrupos com base no …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A SL foi apoiada pelo Conselho chinês de Bolsas. A KT foi apoiada pela bolsa BIH-MD do Instituto de Saúde de Berlim e do Sonnenfeld-Stiftung. A RX é apoiada pelo Programa de Cientista Clínico BIH-Charité, financiado pela Charité -Universitätsmedizin Berlin e pelo Instituto de Saúde de Berlim. Reconhecemos o apoio da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) e do Fundo de Publicação de Acesso Aberto de Charité – Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
Riferimenti
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