Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung reproduzierbarer, kleinräumiger künstlicher Lungengewebe, indem dezellularisierte, präzisionsgeschnittene Lungenschnitte mit alveolären Epithel-Typ-2-Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen neu besiedelt werden.
Es besteht ein Bedarf an verbesserten 3-dimensionalen (3D) Lungenmodellen, die die architektonische und zelluläre Komplexität des nativen Lungenalveolus ex vivo rekapitulieren. Kürzlich entwickelte Organoidmodelle haben die Expansion und Untersuchung von Lungenepithelvorläufern in vitro erleichtert, aber diese Plattformen basieren typischerweise auf Maustumor-abgeleiteter Matrix und / oder Serum und umfassen nur ein oder zwei zelluläre Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von technisch hergestelltem Lungengewebe (ELTs), das auf der Multi-Lineage-Rezellularisierung von dezellularisierten, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten (PCLS) basiert. ELTs enthalten alveolarähnliche Strukturen, bestehend aus Alveolarepithel, Mesenchym und Endothel, in einem extrazellulären Matrixsubstrat (ECM), das dem der nativen Lunge sehr ähnlich ist. Um das Gewebe zu erzeugen, werden die Lunge der Ratten mit Agarose aufgeblasen, in 450 μm dicke Scheiben geschnitten, in Streifen geschnitten und entzelluliert. Die resultierenden azellulären EZM-Gerüste werden dann mit primären Endothelzellen, Fibroblasten und alveolären Epithel-Typ-2-Zellen (AEC2s) neu gesät. AEC2s können in ELT-Kultur für mindestens 7 Tage mit einem serumfreien, chemisch definierten Wachstumsmedium gehalten werden. Während des gesamten Gewebevorbereitungs- und Kulturprozesses werden die Scheiben in ein Kassettensystem geschnitten, das die Handhabung und standardisierte Zellaussaat mehrerer ELTs parallel ermöglicht. Diese ELTs stellen eine organotypische Kulturplattform dar, die die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen innerhalb der Alveole sowie von biochemischen Signalen, die AEC2s und ihre Nische regulieren, erleichtern soll.
Alveolen sind die funktionellen Einheiten der distalen Lunge, die ein Geflecht aus gasaustauschenden Lufträumen umfassen, die von alveolären Epithelzellen (AEC1s) und Typ-2-Zellen (AEC2s) ausgekleidet sind. Dem Epithel liegt ein dichtes Netzwerk von Kapillaren sowie Stützmesenchym zugrunde, die alle durch ein extrazelluläres Matrixgerüst (ECM) gestützt werden, das diesen empfindlichen Luftsäcken sowohl Stärke als auch Flexibilität verleiht1. Die Alveolen sind auch der Ort der Verletzung bei zahlreichen Lungenerkrankungen, einschließlich idiopathischer Lungenfibrose2, akutem Atemnotsyndrom3 und schwerer Coronavirus-Krankheit-19 (COVID-19)4. Obwohl die Arbeit in den letzten zehn Jahren eine bemerkenswerte Plastizität im Lungenepithel aufgedeckt hat, bleiben die Mechanismen, die in einigen Situationen eine distale Lungenreparatur ermöglichen – und die eine Reparatur in anderen ausschließen – ein Bereich intensiver Untersuchungen5. Die Entwicklung verbesserter In-vitro-Plattformen zur Modellierung des Alveolus würde Studien der alveolären Biologie, Regeneration und Therapeutika erleichtern.
AEC2s erneuern sich selbst und differenzieren sich zu AEC1s und gelten somit als primäre Stammzelle der distalen Lunge 6,7,8. Diese Zellen stellen jedoch eine besondere Herausforderung für die In-vitro-Studie dar, da es schwierig ist, primäre AEC2s ohne Verlust des Phänotyps9 zu kultivieren. In konventioneller 2-dimensionaler (2D) Kultur flachen AEC2s ab und übernehmen einige Merkmale von AEC1-ähnlichen Zellen10. Im Gegensatz dazu unterstützen 3D-Kulturstrategien, am häufigsten Organoide, die Aufrechterhaltung differenzierter Merkmale in primären AEC2s 6,11,12 und ermöglichen die langfristige Kultur von pluripotenten Stammzellen (PSC)-abgeleiteten AEC2s13,14. Organoide wurden verwendet, um die distale Lungenentwicklung 15, die Virusinfektion 11,15 und die AEC2-bedingte genetische Erkrankung13,16,17 zu modellieren, was wichtige Einblicke in die Biologie und Regeneration von AEC2 ermöglicht. Diese Kulturmodelle umfassen jedoch typischerweise nur ein oder zwei zelluläre Linien und betten die Zellen in gelartige Matrizen ein, die weder die Architektur noch das ECM-Substrat der nativen Lungenalveole rekapitulieren.
Das ECM ist ein kritischer Regulator des Zellphänotyps und des Verhaltens über molekulare, topologische und mechanische Hinweise; umfasst eine Schlüsselkomponente gewebespezifischer Nischen, die das Stammzellschicksal regeln; und dient als Reservoir, das die Verfügbarkeit von lokal sezernierten Wachstumsfaktoren 18,19,20,21 moduliert. Die Kultivierung von Zellen auf nativem ECM kann somit die Vorhersagefähigkeit von In-vitro-Systemen erhöhen, die Biologie von In-vivo-Geweben zu modellieren. Dezellularisierung, ein Prozess, bei dem Zellmaterial durch Reinigungsmittel, Enzyme oder physikalische oder andere Methoden aus Geweben entfernt wird, kann bei sorgfältiger Durchführung zu einem großen Teil das EZM-Gerüst eines nativen Organs erhalten22,23. Solche Gerüste können mit Zellen für die biomimetische 3D-Kultur wieder bevölkert werden. Während dezellularisierte Gerüste jedoch häufig für Tissue-Engineering-Anwendungen verwendet werden, war ihre Verwendung für die routinemäßige Zellkultur begrenzt. Mehrere frühere Studien haben über die Dezellularisierung und Rezellularisierung von Lungenschnitten oder kleinen Lungengewebesegmenten berichtet. Zusätzlich zu den Proof-of-Concept-Studien 24,25,26 wurden wiederbesiedelte Lungenschnitte verwendet, um die Fibroblasten-Matrix-Adhäsion 27,28 zu untersuchen und die Wirkung erkrankter Lungenmatrizen auf den Fibroblasten-Phänotyp27,29 zu untersuchen. Mit verbesserten Technologien zur Erzeugung von präzisionsgeschnittenen Gewebeschnitten könnten dezellularisierte Lungenschnitte eine bequeme und kleinräumige Plattform bieten, mit der Zellen kultiviert werden können, während Alveolar-, Atemwegs- und Gefäßsubstrukturen erhalten bleiben. Die Einbeziehung mehrerer Zelltypen würde Studien von Zell-Zell-Interaktionen innerhalb einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung ermöglichen. Es sind jedoch verbesserte Strategien erforderlich, um die Handhabung von Geweben während des gesamten Kulturprozesses zu erleichtern und eine kontrollierte und reproduzierbare Aussaat von Geweben mit bekannter Anzahl von Zellen sicherzustellen.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von künstlich hergestelltem Lungengewebe (ELTs) vor, indem dezellularisierte präzisionsgeschnittene Lungenschnitte (PCLS) mit primären Endothelzellen, AEC2s und Fibroblasten neu besiedelt werden. In einer Adaption unseres zuvor beschriebenen technischen Herzgewebesystems 30 und der Dezellularisierungs-Recellularisierungsstrategien der ganzen Lunge 22,31 beschreiben wir Verfahren zum Schneiden von PCLS aus der Lunge von Ratten und zum Schneidender Scheiben in wiederverwendbare Gewebekulturkassetten, die nachgelagerte Manipulationen vereinfachen und standardisieren. Beschnittene Scheiben werden dezellularisiert, um azelluläre EZM-Gerüste zu bilden, die in maßgeschneiderten Aussaatbädern wieder bevölkert werden. Lungenschnittgerüste bewahren kritische ECM-Komponenten und -Architektur und unterstützen das Wachstum von AEC2s in multi-lineage alveolar-ähnlichen Strukturen für mindestens 7 Tage. ELTs stellen ein neuartiges alveoläres Kokultursystem innerhalb einer physiologisch relevanten 3D-Matrix dar, das die Entwicklung von Lungengewebe-Engineering-Strategien unterstützen und gleichzeitig grundlegende biologische Studien von AEC2s und der Alveole erleichtern soll.
Dieses Papier beschreibt die Verwendung von dezellularisierten, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten als Plattform zur Erzeugung von künstlich hergestelltem Lungengewebe in vitro, das alveolarähnliche Strukturen mit mehreren Linien enthält. Durch die Kombination von Strategien, die wir zuvor entwickelt haben, um hochgenaue azelluläre ECM-Lungengerüste für das gesamte Lungen-Engineering22,31 mit unserem robusten System zur Kultivierung von kleinräumigem Herzgewebe 30 neu zu besiedeln, ermöglicht dieses Protokoll die Verwendung von physiologisch relevanter Lungen-ECM als Gewebekultursubstrat in einer wiederholbaren und moderaten Durchsatzweise.
Die hier vorgestellten Methoden beschreiben die ELT-Gerüstvorbereitung aus Rattenlungen, die leicht erreichbar sind, en bloc mit direktem Zugang zu intakten Atemwegen für Agaroseinflation extrahiert werden können und größer sind als die Mauslunge. Innerhalb dieses Systems kann jedoch jedes Lungengewebe verwendet werden, das mit Agarose aufgeblasen werden kann und Scheiben von mindestens 9 mm Länge ergibt. Unabhängig von der Gewebequelle ist eine gleichmäßige Aufblasung des Lungengewebes mit Agarose der kritischste Schritt, um den Erfolg des nachgeschalteten Gewebeschneidens, Clippings und Gewebehandlings sicherzustellen. Unteraufgeblasenes Lungengewebe neigt dazu, nicht sauber zu schneiden, während überblasenes Gewebe während des Clippings reißen kann. Nach der Agarosegelierung sind entsprechend aufgeblasene Geweberegionen fest, geben aber ein wenig nach, wenn sie sanft mit einer Pinzette gedrückt werden. Für intakte Rattenlungen fanden wir heraus, dass das mehrmalige Voraufblasen der extrahierten Lungen mit Luft, gefolgt von einer Agaroseinflation so bald wie möglich nach der Extraktion, zu den besten Schneideergebnissen und der besten Qualität der resultierenden Gewebegerüste führt. Die entsprechende Menge an Agarose muss empirisch optimiert werden; für eine Rattenlunge beträgt das Volumen, das benötigt wird, um die Lunge zur Gesamtlungenkapazität aufzublasen, etwa 30 ml/kg Tiermasse (z. B. 10,5 ml Agarose für Lungen von einer 350 g Ratte). Bei größeren resezierten Lungengeweben mit weniger einfachem Zugang zu den Atemwegen (z. B. von menschlichen Spendern) kann eine zusätzliche Fehlerbehebung erforderlich sein, um das Gewebe über einen Bronchus32 aufzublasen. Während des anschließenden Lungenschneidens ist die Auswahl und Orientierung des Gewebes auf dem Kolben ein weiterer wichtiger Schritt, um 1) sicherzustellen, dass die Scheiben groß genug sind, um Gewebestreifen zu erzeugen, die in Gewebekulturkassetten geschnitten werden können, und 2) die parenchymale (alveolar) Gewebefläche zu maximieren, mit Ausnahme großer Atemwege oder Gefäße.
Das Einschneiden des PCLS in Gewebekulturkassetten kann zunächst ein schwieriger Schritt sein, aber die Kassetten vereinfachen die Gewebehandhabung während der Dezellularisierung und Aussaat erheblich. Zwei mögliche Probleme, die auftreten können, sind das Reißen von Gewebe (entweder während des Clippings oder während der Dezellularisierung) oder die Gewebepositionierung in den Clips, die zu einer schlechten nachgeschalteten Aussaat führt (z. B. keine Aussaat oder Aussaat nur an den Enden). Ein Reißen kann das Ergebnis einer Überinflation von Agarose, einer Überdehnung des Gewebes während des Einführens der Lasche oder eines zu geringen Überhangs sein, um beim Einsetzen der Laschen einen ausreichenden Gewebegriff zu gewährleisten. Beachten Sie, dass Scheiben, die an einem Clip-Ende reißen, erfolgreich gesät werden können, jedoch sind sie während der Kultur unter dem Mikroskop schwer zu visualisieren, da das Gewebe nicht flach ist. Eine schlechte Gewebeaussaat (wie in Abbildung 6C) ist wahrscheinlich das Ergebnis davon, dass die Scheibe nicht flach zwischen den beiden Clips liegt und somit einen schlechten Kontakt mit der Basis des Aussaatbades hat, wenn sie auf den Kopf gestellt wird. Eine weitere mögliche Ursache ist das unsachgemäße Sitzen der Kassette im Boden des Aussaatbadbrunnens. Wenden Sie in Bezug auf das Clipping etwas mehr Spannung in das Gewebe an, wenn Sie den zweiten Clip platzieren, damit er flach liegt. Einige Scheiben haben eine leichte Konkavität; In diesen Fällen schneiden Sie die Scheibe mit der konvexen Seite nach oben ab. Mit der Praxis erleben wir in der Regel eine fehlgeschlagene Aussaat mit weniger als 2% der Scheiben.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Anforderung einiger Spezialgeräte – ein Laserschneider und ein 3D-Drucker -, um die Ausgangsmaterialien für die ELT-Vorbereitung zu generieren. Sobald jedoch die Gewebekulturkassetten und Aussaatbäder erstellt sind, sind keine zusätzlichen Spezialmaterialien erforderlich. Die Lungenschneide- und Dezellularisierungsschritte der ELT-Gerüstvorbereitung sind mäßig zeitaufwendig; Diese Schritte können jedoch im Voraus oder in ausreichender Anzahl durchgeführt werden, um mehrere Experimente gleichzeitig vorzubereiten. Viele PCLS (>100 bei Optimierung für Parenchymregionen) können aus einer einzigen Lunge geschnitten und für den späteren Gebrauch eingefroren werden. Während ein einzelner Frost-Tau-Zyklus geringfügige ultrastrukturelle Schäden am ECM46 verursachen kann, hat sich gezeigt, dass selbst mehrere Frost-Tau-Zyklen keinen signifikanten Verlust in ECM 23,47 verursachen. PCLS kann auch vor einem Experiment abgeschnitten und dezellularisiert werden, um innerhalb eines Monats verwendet zu werden. (Insbesondere kann das beschriebene Dezellularisierungsprotokoll in etwa 6 Stunden durchgeführt werden, was einen erheblichen Vorteil gegenüber zuvor beschriebenen Methoden darstellt, die einen Tag oder mehr erfordern27,28.) Sobald die Gerüste vorbereitet sind, ist der Zellaussaatprozess einfach und schnell, und die Kultur von ELTs erfordert keine speziellen Techniken.
Ein Vorbehalt der beschriebenen ELT-Methode ist das Fehlen einer regionsspezifischen Aussaat, d. h. der Abgabe von AEC2s spezifisch an den Alveolarraum oder Endothelzellen spezifisch an den Gefäßraum. Obwohl Zellen einfach auf den Gewebegerüsten gesät werden, ist das Muster der Rezellularisierung nicht zufällig, mit einem Anschein einer alveolarähnlichen Organisation, einschließlich Epithelringen. Wir vermuten, dass Zell-Zell-Interaktionen sowie lokale Unterschiede in der ECM-Zusammensetzung und -Geometrie20,21 wahrscheinlich zu den beobachteten Rezellularisierungsmustern beitragen. Zur Unterstützung dieser Hypothese zeigte eine zuvor veröffentlichte Studie, in der Fibroblasten unspezifisch auf dezellularisierte Lungenschnitte ausgesät wurden, dass das Muster der Geweberepopulation und der assoziierten zellulären Phänotypen signifikant nach mikroskopischer Geweberegion und ECM-Gerüstquelle (z. B. gesund versus krank) variierte27. Es wurde auch beobachtet, dass Fibroblasten in das Interstitium eindringen – den Ort, an dem sie sich im nativen Lungengewebe befinden 1,27. Die primäre alternative Methode, die wir uns vorstellen können, um Zellen auf Lungenschnitten in einer wirklich regionsspezifischen Weise zu kultivieren, würde darin bestehen, intakte dezellularisierte Lungen über die Atemwege31,48 und Gefäßkompartimente 49,50 zu säen und dann das rezellularisierte Gewebe zu schneiden. Diese Alternative 1) ist jedoch deutlich kosten-, zeit- und ressourcenintensiver; 2) ist ein geringerer Durchsatz; 3) erfordert eine erhöhte Anzahl von Tieren; und 4) ist mit einem erhöhten Kontaminationsrisiko aufgrund der Herausforderungen der gesamten Lungenkultur und des anschließenden Schneidens der ausgesäten Lunge verbunden. Die ELT-Plattform rekapituliert zwar nicht alle Aspekte der nativen zellulären Organisation, ermöglicht jedoch die Lungenzellkultur auf einem physiologisch relevanten ECM-Substrat auf eine Weise, die für viele weitere Labore zugänglich ist.
Die Flexibilität des ELT-Systems ist ein großer Vorteil dieser Plattform und sollte eine kleinräumige Lungengewebekultur mit einer beliebigen Anzahl von Gewebegerüsten, Zellen oder Kulturmedien von Interesse ermöglichen. Die Verwendung von Gerüsten, die aus erkranktem Gewebe oder aus Verletzungsmodellen gewonnen werden, kann die Untersuchung von Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Interaktionen unter Berücksichtigung der krankheitsveränderten ECM27,29,51 ermöglichen. Beachten Sie jedoch, dass das Dezellularisierungsprotokoll möglicherweise angepasst werden muss, um Matrixunterschiede zwischen Spezies52 zu berücksichtigen. Die beschriebene Seeding-Strategie kann für jeden Zelltyp verwendet werden, und die Kulturzeitleiste kann an die Bedürfnisse des Forschers angepasst werden. Als Ausgangspunkt sollten 1 x 106 Zellen pro Gerüst innerhalb von 7 Tagen nach der Kultur ein hochzelliges Gewebe ergeben, während 1 x 105 Gesamtzellen zu einer schlechten Zellularität führen. Bei jeder Anpassung des Zeitrahmens sollten die Gewebekulturkassetten 24 h nach der letzten Gewebeaussaat aus dem Aussaatbad entfernt werden. Mit dem Ziel, einen Teil der zellulären Komplexität des Lungenalveolus zu modellieren, beschreiben wir hier eine Trikultur-Rezellularisierungsstrategie, die die Aufrechterhaltung gut differenzierter neonataler AEC2s in alveolarähnlichen Strukturen für mindestens 7 Tage unterstützt. Unsere Ergebnisse zeigen auch die erfolgreiche Transplantation von Fibroblasten und Endothelzellen innerhalb von ELTs, was die breite Anwendbarkeit des Kultursubstrats und seine Eignung für Co-Kulturstudien unterstreicht. Die Aussaat adulter Zellen in ELTs kann die Modellierung ruhigerer alveolarer Strukturen erleichtern, während die Aussaat humaner PSC-abgeleiteter AEC2s, einschließlich solcher mit genetischen Modifikationen, translationale Studien der menschlichen Krankheiterleichtern könnte 13,53. Im Allgemeinen bietet der Bottom-up-Ansatz, der durch die ELT-Plattform ermöglicht wird, die Beiträge bestimmter Zelltypen zu Auslesungen von Interesse zu untersuchen – wie z.B. AEC2-Proliferation oder Differenzierungszustand.
Zusammenfassend skizziert dieses Protokoll ein robustes System zur Erzeugung von künstlichem Lungengewebe für Co-Kulturstudien von AEC2s, Fibroblasten und Endothelzellen in azellulären ECM-Lungenschnittgerüsten. ELTs stellen eine neuartige 3D-Kulturstrategie für primäre AEC2s dar, die sich bisher typischerweise auf weniger physiologische Gel-Matrizen stützten, um einen gut differenzierten Phänotyp 6,11,12 aufrechtzuerhalten. Die aktuelle Plattform baut auf früheren Arbeiten zur Wiederbesiedlung von dezellularisierten Lungenschnitten 24,25,26,27,28,29 auf, bietet aber mehrere Vorteile: 1) ein Gewebekultur-Kassettensystem, um die ELT-Handhabung während der Dezellularisierung, Aussaat und Kultur zu erleichtern; 2) ein maßgeschneidertes Aussaatbad, um eine bekannte Anzahl von Zellen auf jedem Scheibengerüst präzise zu säen; und 3) eine Tri-Kultur-Reseeding-Strategie, die eine Wiederbesiedlung von Alveolargewebe mit Epithel-, mesenchymalen und Endothelzellen ermöglicht. Somit stellen ELTs einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Erstellung reproduzierbarer In-vitro-Modelle dar, die die Zell- und Substratkomplexität der nativen Alveole und der AEC2-Stammzellnische erfassen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Lorenzo Sewanan und Jorge Nunez für ihre Arbeit bei der Entwicklung des in diesem Protokoll verwendeten Gewebekulturkassettendesigns, dem Kaminski-Labor für die Verwendung ihres Vibratoms, Maurizio Chioccioli und Jessica Nouws für die Unterstützung beim Lungenschneiden, Allie LaRocco für die Unterstützung bei ersten Pilotexperimenten und Hong Qian für das sorgfältige Lesen des Protokolls. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse F30HL143880 (K.L.L.), das Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) und U01HL145567 (L.E.N.) unterstützt; und durch ein uneingeschränktes Forschungsgeschenk von Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |