Этот протокол описывает метод получения воспроизводимых, мелкомасштабных инженерных легочных тканей путем повторного заселения децеллюляризованных прецизионных срезов легких альвеолярными эпителиальными клетками типа 2, фибробластами и эндотелиальными клетками.
Существует потребность в улучшенных 3-мерных (3D) моделях легких, которые повторяют архитектурную и клеточную сложность нативной альвеолы легких ex vivo. Недавно разработанные органоидные модели облегчили расширение и изучение предшественников эпителия легких in vitro, но эти платформы обычно полагаются на матрицу и / или сыворотку, полученную из опухоли мыши, и включают только одну или две клеточные линии. Здесь мы описываем протокол генерации инженерных легочных тканей (ELT), основанный на многолинейной рецеллюляризации децеллюляризированных прецизионных срезов легких (PCLS). ELT содержат альвеоляроподобные структуры, включающие альвеолярный эпителий, мезенхиму и эндотелий, в субстрате внеклеточного матрикса (ECM), очень напоминающем субстрат нативного легкого. Для генерации тканей легкие крыс раздувают агарозой, нарезают на ломтики толщиной 450 мкм, разрезают на полоски и децеллюляризируют. Полученные бесклеточные каркасы ECM затем пересеивают первичными эндотелиальными клетками, фибробластами и альвеолярными эпителиальными клетками типа 2 (AEC2s). AEC2s можно поддерживать в культуре ELT в течение не менее 7 дней с несывороточной, химически определенной питательной средой. На протяжении всего процесса подготовки ткани и культивирования срезы обрезаются в кассетную систему, которая облегчает обработку и стандартизированное посев клеток нескольких ELT параллельно. Эти ELT представляют собой органотипическую культуральную платформу, которая должна облегчить исследования клеточно-клеточных и клеточно-матричных взаимодействий в альвеоле, а также биохимических сигналов, регулирующих AEC2 и их нишу.
Альвеолы являются функциональными единицами дистального легкого, состоящими из сетки газообменных воздушных пространств, выстланных альвеолярными эпителиальными клетками типа 1 (AEC1s) и клетками типа 2 (AEC2s). В основе эпителия лежит плотная сеть капилляров, а также поддерживающая мезенхима, поддерживаемая каркасом внеклеточного матрикса (ECM), который обеспечивает как прочность, так и гибкость этим тонким воздушным мешочкам1. Альвеолы также являются местом повреждения при многочисленных патологиях легких, включая идиопатический легочный фиброз2, острый респираторный дистресс-синдром3 и тяжелую коронавирусную болезнь-19 (COVID-19)4. Хотя работа за последнее десятилетие выявила замечательную пластичность в эпителии легких, механизмы, которые позволяют дистальное восстановление легких в некоторых условиях – и которые исключают восстановление в других – остаются областью интенсивного исследования5. Разработка улучшенных платформ in vitro для моделирования альвеол облегчит исследования альвеолярной биологии, регенерации и терапии.
AEC2s самообновляются и дифференцируются в AEC1s, и, таким образом, считаются первичной стволовой клеткой дистального легкого 6,7,8. Тем не менее, эти клетки представляют собой особую проблему для исследования in vitro, учитывая трудности, связанные с культивированием первичных AEC2 без потери фенотипа9. В обычной 2-мерной (2D) культуре AEC2s сплющиваются и принимают некоторые особенности AEC1-подобных клеток10. Напротив, стратегии 3D-культур, чаще всего органоиды, поддерживают поддержание дифференцированных признаков в первичных AEC2s 6,11,12 и позволяют долгосрочную культивирование AEC2s13,14, полученной из плюрипотентных стволовых клеток (PSC). Органоиды были использованы для моделирования дистального развития легких15, вирусной инфекции 11,15 и связанных с AEC2 генетических заболеваний 13,16,17, что позволяет получить важную информацию о биологии и регенерации AEC2. Однако эти модели культур обычно содержат только одну или две клеточные линии и встраивают клетки в матрицы гелевого типа, которые не могут повторить ни архитектуру, ни СУБСТРАТ ECM нативной альвеолы легких.
ECM является критическим регулятором фенотипа и поведения клеток с помощью молекулярных, топологических и механических сигналов; содержит ключевой компонент тканеспецифических ниш, регулирующих судьбу стволовых клеток; и служит резервуаром, модулирующим наличие локально секретируемых факторов роста 18,19,20,21. Таким образом, культивирование клеток на нативном ECM может увеличить прогностическую способность систем in vitro моделировать биологию тканей in vivo. Децеллюляризация, процесс, который удаляет клеточный материал из тканей с помощью моющих средств, ферментов или физических или других методов, может в значительной степени сохранить каркас ECM нативного органа при тщательном выполнении22,23. Такие каркасы могут быть повторно заселены клетками для 3D биомиметической культуры. Однако, в то время как децеллюляризованные каркасы широко используются для тканевой инженерии, их использование для рутинной клеточной культуры было ограничено. В нескольких предыдущих исследованиях сообщалось о децеллюляризации и рецеллюляризации срезов легких или небольших сегментов легочной ткани. В дополнение к доказательствам концепцииисследований 24,25,26, повторно заселенные срезы легких были использованы для изучения адгезии фибробласт-матрикс 27,28 и для изучения влияния больных матриц легких на фенотип фибробластов 27,29. Благодаря улучшенным технологиям, доступным для создания прецизионных срезов тканей, децеллюляризированные срезы легких могут предложить удобную и мелкомасштабную платформу для культивирования клеток, сохраняя при этом альвеолярные, дыхательные и сосудистые субструктуры. Включение нескольких типов клеток позволит проводить исследования клеточных взаимодействий в физиологически значимой 3D-среде. Тем не менее, необходимы улучшенные стратегии для облегчения обработки тканей на протяжении всего процесса культивирования и для обеспечения контролируемого и воспроизводимого посева тканей известным количеством клеток.
Здесь мы представляем протокол для генерации инженерных легочных тканей (ELT) путем повторного заселения децеллюляризованных прецизионных срезов легких (PCLS) первичными эндотелиальными клетками, AEC2 и фибробластами. В адаптации нашей ранее описанной инженерной системысердечной ткани 30 и стратегий децеллюляризации-рецеллюляризации всего легкого22,31 мы описываем процедуры по вырезанию PCLS из легких крыс и обрезанию срезов в многоразовые кассеты культуры тканей, которые упрощают и стандартизируют последующие манипуляции. Обрезанные ломтики децеллюляризируются с образованием бесклеточных каркасов ECM, которые повторно заполняются в специальных посевных ваннах. Каркасы среза легких сохраняют критические компоненты и архитектуру ECM и поддерживают рост AEC2 в многолинейных альвеолярных структурах в течение не менее 7 дней. ELT представляют собой новую альвеолярную кокультурную систему в физиологически значимой 3D-матрице, которая должна поддерживать разработку стратегий инженерии легочной ткани, одновременно облегчая основные биологические исследования AEC2s и альвеол.
В этой статье описывается использование децеллюляризированных прецизионных срезов легких в качестве платформы для создания инженерных легочных тканей in vitro, которые содержат многолинейные альвеолярные структуры. Комбинируя стратегии, которые мы ранее разработали для повторного заселения высокоточных бесклеточных каркасов легких ECM для всей легочной инженерии22,31, с нашей надежной системой культивирования мелкомасштабных инженерных тканей сердца30, этот протокол позволяет использовать физиологически релевантный ECM легких в качестве субстрата культуры тканей повторяемым и умеренно-пропускным способом.
Методы, представленные здесь, детализируют подготовку каркаса ELT из легких крыс, которые легко достижимы, могут быть извлечены блоком с прямым доступом к интактным дыхательным путям для инфляции агарозы и имеют больший размер, чем легкие мыши. Однако любая легочная ткань, которая может быть раздута агарозой и дает срезы длиной не менее 9 мм, может быть использована в этой системе. Независимо от источника ткани, равномерное раздувание легочной ткани с агарозой является наиболее важным шагом для обеспечения успеха последующего нарезки тканей, клипирования и обработки тканей. Недодутая легочная ткань, как правило, не разрезается чисто, в то время как перекачанная ткань может порваться во время клипирования. После гелеобразования агарозы соответствующим образом раздутые участки ткани становятся твердыми, но обеспечивают небольшую отдачу при мягком надавливании щипцами. Для интактных легких крыс мы обнаружили, что предварительное раздувание извлеченных легких воздухом несколько раз с последующим напылением агарозы как можно скорее после экстракции приводит к лучшим результатам нарезки и лучшему качеству полученных тканевых каркасов. Соответствующий объем агарозы нуждается в эмпирической оптимизации; для легкого крысы объем, необходимый для раздувания легкого до общей емкости легкого, составляет приблизительно 30 мл / кг массы животных (например, 10,5 мл агарозы для легких от крысы весом 350 г). Для более крупных резецированных легочных тканей с менее простым доступом к дыхательным путям (например, от доноров-людей) может потребоваться некоторое дополнительное устранение неполадок для раздувания ткани через бронх32. Во время последующей нарезки легких выбор и ориентация ткани на плунжере является еще одним важным шагом для 1) обеспечения того, чтобы срезы были достаточно большими, чтобы генерировать полоски ткани, которые могут быть обрезаны в кассеты культуры тканей и 2) максимизировать паренхиматозную (альвеолярную) область ткани, исключая крупные дыхательные пути или сосуды.
Обрезание PCLS в кассеты культуры тканей может быть сложным этапом на начальном этапе, но кассеты значительно упрощают обработку тканей во время децеллюляризации и посева. Двумя потенциальными проблемами, которые могут возникнуть, являются разрыв ткани (либо в процессе обрезки, либо во время децеллюляризации), или позиционирование ткани в клипсах, что приводит к плохому посеву вниз по течению (например, отсутствие посева или посев только на концах). Разрыв может быть результатом чрезмерной агарозы, перерастяжения ткани во время вставки вкладки или оставления слишком небольшого свеса, чтобы обеспечить адекватное сцепление ткани при вставке вкладок. Обратите внимание, что срезы, которые разрываются на одном конце зажима, могут быть успешно засеяны, однако их трудно визуализировать под микроскопом во время культивирования, так как ткань не плоская. Плохой посев тканей (например, на рисунке 6C), вероятно, является результатом того, что срез не лежит плоско между двумя зажимами и, таким образом, плохо контактирует с основанием посевной ванны при переворачивании вверх дном. Еще одной возможной причиной является неправильное размещение кассеты в нижней части колодца для посева ванны. С точки зрения обрезки, примените немного больше напряжения в ткани при размещении второго зажима, чтобы помочь ему лежать ровно. Некоторые срезы имеют небольшую вогнутость; в этих случаях обрежьте фрагмент выпуклой стороной вверх. С практикой мы обычно испытываем неудачный посев с менее чем 2% ломтиков.
Одним из ограничений этого протокола является требование к некоторому специализированному оборудованию – лазерному резаку и 3D-принтеру – для генерации исходных материалов для подготовки к ELT. Однако, как только кассеты для посева тканей и семенные ванны созданы, никаких дополнительных специальных материалов не требуется. Этапы нарезки легких и децеллюляризации препарата ELT являются умеренно трудоемкими; однако эти шаги могут быть выполнены заранее или в количестве, достаточном для подготовки к нескольким экспериментам одновременно. Многие PCLS (>100, если оптимизированы для паренхиматозных областей) могут быть вырезаны из одного легкого и заморожены для последующего использования. В то время как один цикл замораживания-оттаивания может привести к незначительным ультраструктурным повреждениям ECM46, было продемонстрировано, что даже несколько циклов замораживания-оттаивания не вызывают значительных потерь в ECM 23,47. PCLS также может быть обрезан и децеллюляризирован до начала эксперимента, который будет использоваться в течение одного месяца. (Примечательно, что описанный протокол децеллюляризации может быть выполнен примерно за 6 часов, что представляет собой значительное преимущество перед ранее описанными методами, которые требуют суток или более 27,28.) После того, как каркасы подготовлены, процесс посева клеток прост и быстр, а культивирование ELT не требует специализированных методов.
Предостережением описанного метода ELT является отсутствие регионально-специфического посева, т.е. доставки AEC2s конкретно в альвеолярное пространство, или эндотелиальные клетки конкретно в сосудистое пространство. Тем не менее, хотя клетки просто засеяны поверх тканевых каркасов, картина рецеллюляризации неслучайна, с некоторым подобием альвеолярной организации, включая эпителиальные кольца. Мы подозреваем, что клеточно-клеточные взаимодействия, а также локальные различия в составе и геометрии ECM20,21, вероятно, способствуют наблюдаемым паттернам рецеллюляризации. В поддержку этой гипотезы ранее опубликованное исследование, в котором фибробласты были посеяны неспецифически на децеллюляризованные срезы легких, продемонстрировало, что картина репопуляции тканей и связанные с ней клеточные фенотипы значительно различаются в зависимости от микроскопической области ткани и источника каркаса ECM (например, здоровый и больной)27. Также наблюдалось, что фибробласты вторгаются в интерстиций – место, в котором они находятся в нативнойлегочной ткани 1,27. Основной альтернативный метод, который мы можем себе представить для культивирования клеток на срезах легких действительно специфичным для региона способом, повлечет за собой посев неповрежденных децеллюляризованных легких через дыхательные пути31,48 и сосудистые компартменты49,50, а затем разрезание рецеллюляризированной ткани. Однако эта альтернатива 1) значительно более затратная, трудоемкая и ресурсоемкая; 2) имеет меньшую пропускную способность; 3) требует увеличения численности животных; и 4) связано с повышенным риском загрязнения из-за проблем с культурой целых легких и последующей нарезкой семенного легкого. Не повторяя все аспекты нативной клеточной организации, платформа ELT позволяет культивировать клетки легких на физиологически значимом субстрате ECM таким образом, чтобы это было доступно для многих других лабораторий.
Гибкость системы ELT является основным преимуществом этой платформы и должна позволять проводить мелкомасштабную культуру легочной ткани с любым количеством тканевых каркасов, клеток или культуральных сред, представляющих интерес. Использование каркасов, полученных из пораженной ткани или из моделей повреждения, может позволить изучить взаимодействия клетки-клетки или клетки-матрицы в условиях измененного заболеванием ECM 27,29,51. Однако обратите внимание, что протокол децеллюляризации, возможно, потребуется адаптировать для учета матричных различий между видами52. Описанная стратегия посева может быть использована для любого типа клеток, а временная шкала культуры адаптирована к потребностям исследователя. В качестве отправной точки 1 х 106 клеток на каркас должны дать высококлеточную ткань в течение 7 дней после культивирования, тогда как 1 х 105 общих клеток приводят к плохой клеточности. При любой адаптации временной шкалы кассеты тканевых культур должны быть удалены из посевной ванны через 24 ч после последнего посева ткани. Здесь, с целью моделирования некоторой клеточной сложности альвеолы легких, мы описываем стратегию рецеллюляризации трехкультур, которая поддерживает поддержание хорошо дифференцированных неонатальных AEC2s в альвеолярных структурах в течение не менее 7 дней. Наши результаты также демонстрируют успешное приживление как фибробластов, так и эндотелиальных клеток в ELT, подчеркивая широкую применимость субстрата культуры и его пригодность для совместных исследований культур. Посев взрослых клеток в ELT может облегчить моделирование более спокойных альвеолярных структур, в то время как посев AEC2, полученных из PSC человека, в том числе с генетическими модификациями, может облегчить трансляционные исследования заболеваний человека13,53. В целом, подход «снизу вверх», поддерживаемый платформой ELT, предоставляет возможность исследовать вклад конкретных типов клеток в считывание, представляющее интерес, такое как пролиферация AEC2 или состояние дифференцировки.
Таким образом, этот протокол описывает надежную систему для генерации инженерных легочных тканей для совместных исследований AEC2s, фибробластов и эндотелиальных клеток в бесклеточных каркасах среза легких ECM. ELT представляют собой новую стратегию 3D-культуры для первичных AEC2, которые на сегодняшний день обычно полагаются на менее физиологические матрицы гелевого типа для поддержания хорошо дифференцированного фенотипа 6,11,12. Текущая платформа основывается на предыдущей работе по репопуляции децеллюляризированных срезов легких 24,25,26,27,28,29, но предлагает несколько преимуществ: 1) кассетную систему тканевой культуры для облегчения обработки ELT во время децеллюляризации, посева и культивирования; 2) индивидуальная посевная ванна для точного засева известного количества клеток на каждом срезе каркаса; и 3) стратегия повторного посева трехкультур, которая позволяет альвеолярной ткани повторно заселяться эпителиальными, мезенхимальными и эндотелиальными клетками. Таким образом, ELT представляют собой важный шаг вперед на пути к созданию воспроизводимых моделей in vitro, которые охватывают клеточную и субстратную сложность нативной альвеолы и ниши стволовых клеток AEC2.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Лоренцо Севанана и Хорхе Нуньеса за их работу по разработке конструкции кассеты тканевой культуры, используемой в этом протоколе, лабораторию Камински за использование их вибратома, Маурицио Кьоччоли и Джессику Ноус за помощь в нарезке легких, Элли ЛаРокко за помощь в первоначальных пилотных экспериментах и Хун Цяня за внимательное чтение протокола. Эта работа была поддержана грантами NIH F30HL143880 (K.L.L.), грантом программы подготовки ученых-медиков T32GM136651 (K.L.L.) и U01HL145567 (L.E.N.); и неограниченным исследовательским подарком от Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |