Konstruert lungevev tilberedt av decellulariserte lungeskiver

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å generere reproduserbare, småskala konstruerte lungevev, ved å repopulere decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver med alveolar epitelial type 2 celler, fibroblaster og endotelceller.

Abstract

Det er behov for forbedrede 3-dimensjonale (3D) lungemodeller som rekapitulerer den arkitektoniske og cellulære kompleksiteten til den opprinnelige lungealveolus ex vivo. Nylig utviklede organoidmodeller har lagt til rette for utvidelse og studier av lungeepiteliske forfedre in vitro, men disse plattformene er vanligvis avhengige av mussvulst-avledet matrise og / eller serum, og innlemmer bare en eller to cellulære avstamninger. Her beskriver vi en protokoll for generering av konstruert lungevev (ELTs) basert på multi-lineage recellularisering av decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver (PCLS). ELTs inneholder alveolar-lignende strukturer som består av alveolar epitel, mesenchyme og endotel, innenfor et ekstracellulært matrise (ECM) substrat som ligner på innfødt lunge. For å generere vevet, blir rotte lunger oppblåst med agarose, skiver i 450 μm tykke skiver, kuttet i strimler og decellularisert. De resulterende acellulære ECM stillasene blir deretter reseeded med primære endotelceller, fibroblaster og alveolar epitelial type 2 celler (AEC2s). AEC2s kan opprettholdes i ELT-kulturen i minst 7 dager med et serumfritt, kjemisk definert vekstmedium. Gjennom vevsforberedelse og kulturprosess blir skivene klippet inn i et kassettsystem som letter håndtering og standardisert cellesåing av flere ELT-er parallelt. Disse ELTene representerer en organotypisk kulturplattform som skal legge til rette for undersøkelser av cellecelle- og cellematriseinteraksjoner i alveolus samt biokjemiske signaler som regulerer AEC2s og deres nisje.

Introduction

Alveoli er de funksjonelle enhetene i den distale lungen, som består av et netting av gassutskiftende luftrom foret av alveolar epitelial type 1 celler (AEC1s) og type 2 celler (AEC2s). Underliggende epitel er et tett nettverk av kapillærer samt støtte mesenchyme, alt buttressed av en ekstracellulær matrise (ECM) stillas som gir både styrke og fleksibilitet til disse delikate luftsekkene¹. Alveolene er også skadestedet i en rekke lungepatologier, inkludert idiopatisk lungefibrose², akutt respiratorisk nødsyndrom³ og alvorlig koronavirussykdom-19 (COVID-19)⁴. Selv om arbeidet det siste tiåret har avdekket en bemerkelsesverdig plastisitet i lungeepitelet, forblir mekanismene som muliggjør distal lungereparasjon i noen sammenhenger – og som utelukker reparasjon i andre – et område med intens undersøkelse⁵. Utviklingen av forbedrede in vitro-plattformer for å modellere alveolus ville lette studier av alveolarbiologi, regenerering og terapeutiske behandlinger.

AEC2s fornyer seg selv og differensierer seg i AEC1s, og regnes dermed som den primære stamcellen til den distale lungen ^6,7,8. Imidlertid utgjør disse cellene en spesiell utfordring for in vitro-studie gitt vanskelighetene forbundet med å dyrke primære AEC2s uten tap av fenotype⁹. I konvensjonell 2-dimensjonal (2D) kultur flater AEC2s ut og vedtar noen funksjoner i AEC1-lignende celler¹⁰. Derimot støtter 3D-kulturstrategier, oftest organoider, vedlikehold av differensierte funksjoner i primære AEC2s ^6,11,12 og tillater langsiktig kultur av pluripotent stamcelle (PSC) -avledet AEC2s^13,14. Organoider har blitt brukt til å modellere distal lungeutvikling¹⁵, virusinfeksjon^11,15 og AEC2-relatert genetisk sykdom 13,16,17, noe som muliggjør viktig innsikt i AEC2 biologi og regenerering. Imidlertid består disse kulturmodellene vanligvis bare av en eller to cellulære avgrensninger, og legger inn cellene i gel-type matriser som ikke klarer å rekapitulere enten arkitekturen eller ECM-substratet til den innfødte lungealveolus.

ECM er en kritisk regulator av cellefenotype og oppførsel via molekylære, topologiske og mekaniske signaler; består av en nøkkelkomponent i vevsspesifikke nisjer som regulerer stamcelle skjebne; og fungerer som et reservoar som modulerer tilgjengeligheten av lokalt utskilte vekstfaktorer 18,19,20,21. Culturing celler på innfødt ECM kan dermed øke prediktiv kapasitet in vitro systemer for å modellere biologien til in vivo vev. Decellularisering, en prosess som fjerner cellulært materiale fra vev via vaskemidler, enzymer eller fysiske eller andre metoder, kan i stor grad bevare ECM-stillaset til et innfødt organ, når det utføres nøye^22,23. Slike stillaser kan fylles på nytt med celler for 3D biomimetisk kultur. Men mens decellulariserte stillaser er mye brukt til vevsteknikkapplikasjoner, har deres bruk for rutinemessig cellekultur vært begrenset. Flere tidligere studier har rapportert decellularisering og recellularisering av lungeskiver eller små lungevevssegmenter. I tillegg til konseptgodkjenningsstudier ^24,25,26, repopulated lunge skiver har blitt brukt til å studere fibroblast-matrise adhesjon^27,28 og for å undersøke effekten av syke lunge matriser på fibroblast fenotype^27,29. Med forbedrede teknologier tilgjengelig for å generere presisjonskuttede vevsskiver, kan decellulariserte lungeskiver tilby en praktisk og liten plattform for kulturceller, samtidig som alveolar, luftveier og vaskulære understrukturer bevares. Inkorporering av flere celletyper vil muliggjøre studier av cellecelleinteraksjoner i et fysiologisk relevant 3D-miljø. Forbedrede strategier er imidlertid nødvendig for å lette håndteringen av vev gjennom hele kulturprosessen, og for å sikre kontrollert og reproduserbar såing av vev med kjent antall celler.

Her presenterer vi en protokoll for å generere konstruerte lungevev (ELTs) ved å repopulere decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver (PCLS) med primære endotelceller, AEC2s og fibroblaster. I en tilpasning av vårt tidligere beskrevne konstruerte hjertevevssystem³⁰ og hele lungedecellulariserings-recellulariseringsstrategier ^22,31, beskriver vi prosedyrer for å kutte PCLS fra rotte lunger og å klippe skivene i gjenbrukbare vevskulturkassetter som forenkler og standardiserer nedstrøms manipulasjoner. Beskårne skiver decellulariseres for å danne acellulære ECM stillaser, som fylles opp igjen i tilpassede såddbad. Lungeskive stillaser bevarer kritiske ECM-komponenter og arkitektur, og støtter veksten av AEC2s innen multi-lineage alveolar-lignende strukturer i minst 7 dager. ELTs representerer et nytt alveolar co-kultursystem innenfor en fysiologisk relevant 3D-matrise, som skal støtte utviklingen av lungevevsteknikkstrategier, samtidig som de legger til rette for grunnleggende biologiske studier av AEC2s og alveolus.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer for dyr som er beskrevet i denne artikkelen, ble godkjent av Yale Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Opprettelse av vevskulturkassetter og såddbad MERK: Når de er laget, kan vevskulturkassetter og sådd bli autoklavert og gjenbrukt for gjentatte runder med ELT-kultur. Vev Kultur Kassetter Bruk en laserkutter til å kutte vevskulturkassettrammer og klips ut av henholdsvis 3/32 tommers tykk polytetrafluoretylen (PTFE) i henhold til designene i henholdsvis tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2. Bruk en laser kutter til å kutte vev kultur kassett faner ut av 1/16 tommers tykk PTFE i henhold til Supplementary File 3. Klipp ut konturene 3x ved hjelp av 80 % effekt og 15 % hastighet (for en 30 W laserkutter). Såing Bad Bruk seeding bad CAD-filer (Supplementary File 4 og Supplementary File 5) til 3D skrive ut base og ring av seeding bad mold, henholdsvis, ved hjelp av klar harpiks. Bløtlegg formene i en løsning på 10% poloksamer 407 i destillert vann over natten før bruk for å hjelpe til med PDMS-frigjøring. La luften tørke, monter deretter ringen over bunnen av formen og pakk inn fleksibel plastfilm for å forhindre lekkasje. Forbered minst 60 g per form av polydimetylsiloksan (PDMS) ved å blande PDMS-elastomer i forholdet 10:1 med herdemiddel, og hell i den 3D-trykte formen. Degas PDMS i en vakuumdesiccator i 30 min for å fjerne eventuelle luftbobler. Stek såddbad ved 60 °C i 8 timer. 2. Tilberedning av presisjonskuttede lungeskiver fra rotte lunger Organ høsting Forbered et delt perfusjonssystem som består av tyngdekrafts- og pumpedrevne lemmer, som avbildet i figur 1. Koble en lungearterie (PA) kanyle til enden av slangen, som består av en 1/16 tommers piggtråd Y-kontakt festet til en 1/2 tommers lengde på LS 14 silikonrør og en 3/32 tommers hunn luer-lock kontakt (se figur 1). Ikke fest en tilbakeslagsventil til kanylen nå. Klargjør linjene med PBS som inneholder henholdsvis 100 U/ml heparin og 0,01 mg/ml natriumnittroprusside (SNP) for antikoagulasjon og vasodilatasjon. Sett perfusjonspumpen på 30 ml/min.MERK: Legg SNP friskt til heparinløsningen og hold den beskyttet mot lys. Doser en voksen (8-12 uker gammel, ca. 300-350 g) Sprague-Dawley rotte med en intraperitoneal (IP) injeksjon av 400 U/kg heparin for antikoagulasjon, etterfulgt av en IP-injeksjon av ketamin (75 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg) for anestesi. Bekreft et kirurgisk plan av anestesi via mangel på respons på skadelig stimulans (tåklemme). Trim brystet og magen av pels ved hjelp av hårklippere. Spray deretter med 70% etanol og tørk 3x med 10% povidon-jod. Ta tak i huden under nivået av membranen med rottetann tang. Lag deretter et 1/2 tommers tverrsnitt i huden med finspisset saks. Ta tak i den eksponerte bukfasciaen med tangene, lag et 1/2 tommers tverrsnitt i fascia, og utvid deretter snittet gjennom huden og fascia over bredden av overlivet. Bruk spissen av den fine saksen til å lage et lite snitt (ikke mer enn 1/8 tommer) i midten av den fremre membranen, noe som får lungene til å trekke seg tilbake i thoraxen. Utvid snittet i membranen over brystets fulle bredde. Lag to vertikale snitt gjennom hele høyden på ribbeina mot nakken, vær forsiktig så du ikke skader lungene. Utvid snittet gjennom venstre ribber for å skjære gjennom kragebeinet og langs siden av nakken til strupehodets nivå, og eksponere luftrøret. Disseker luftrøret fritt for omkringliggende bindevev og fra spiserøret. Lag et tverrgående snitt over den fremre halvdelen av luftrøret mellom to bruskringer, nær strupehodet. Tre en 4-0 polypropylen sutur bak luftrøret, under nivået av snittet, og løst pre-binde første halvdel av en kirurg knute med to vendinger. Plasser en kanyle som består av en 1/16 tommers piggete Y-connecter koblet til en enveis tilbakeslagsventil og en 1/2 tommers lengde på LS 14 silikonrør med en 3/32 tommers kvinnelig luer-lock-kontakt (se figur 1) i luftrøret ved å sette inn en lem av Y-kontakten i trakeal snittet mot retningen av lungene. Plasser den forhåndsbundet suturløkken rundt luftrøret på nivået av den innsatte kanylen og stram rundt den innsatte Y-kontakten for å feste kanylen på plass. Tilsett to enkelt-vri kast av suturen for å fullføre knuten. Fyll en 10 ml sprøyte med luft og koble til luerlåsen på trakealkanylen. Klem den dårligere vena cava nær membranen ved hjelp av en buet hemostat, og injiser deretter hjertet med 150 U heparin (1000 U / ml) via høyre ventrikel (RV). Åpne gravitasjonslinjens stoppekran delvis, for å produsere en langsom, men jevn drypping av PBS/heparin/SNP fra PA-kanylen som ble utarbeidet i trinn 2.1.1. Tre nålen på en 4-0 polypropylen sutur bak bunnen av PA der den går ut av bobilen. Bruk første halvdel av en kirurgs knute for å knytte en løs sutursløyfe rundt bunnen av PA. Lag et lite snitt (ikke mer enn 1/8 tommer) i bobilen like under og vinkelrett på PA ved hjelp av fin saks, og sett deretter en lem av PA cannula Y-kontakten inn i bunnen av PA. Fest suturen rundt PA og den innsatte kontakten og legg til et enkelt vridningskast for å fullføre kirurgens knute.MERK: Kannulering av PA under strømning forhindrer innføring av luftbobler i vaskulaturen som kan utelukke tilstrekkelig rydding av lungene. Fest en enveisventil til den andre enden av PA-kateterets Y-kontakt, og klipp deretter av toppen av hjertet for å tillate blodstrømsutløp via venstre ventrikel.MERK: Unnlatelse av å kutte av toppen av hjertet før perfusing via pumpen kan forårsake skade på blodgassbarrieren, noe som fører til lekkasje av væske i luftrommet. Bytt perfusjonsledningen til pumpesiden ved hjelp av stoppekranen som forbinder de to linjene, og slå deretter på pumpen ved 30 ml/min. Mens du parfymerer lungene via PA, ventiler lungene manuelt via 10 ml trakeal sprøyte ved ca. 10-15 pust / min, for å lette rydding av lungene i blod. Perfuse lungene til de blir for det meste hvite, vanligvis krever 40 ml PBS / heparin / SNP eller mindre.MERK: Utilstrekkelig rydding av lungene i blod kan svekke nedstrøms decellularisering. Klipp den bakre luftrøret like over nivået på trakealkanylen, og disseker deretter lungene og hjertet fri for alt gjenværende bindevev og trekk ut lungene og hjertet en blokk. Fyll en 10 ml sprøyte med 2 % lavt smeltepunkt i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) uten fenolrød, forvarsel til 42 °C.MERK: Det nøyaktige volumet av agarose som kreves vil variere etter lungestørrelse. Større lunger (dvs. fra rotter større enn 400 g) vil kreve mer enn 10 ml agarose. Blås opp de ekstraherte lungene manuelt 3x med 10 ml luft (dvs. til omtrent total lungekapasitet) via luftrørets kanyle for å rekruttere kollapset parenchyma. Blås umiddelbart opp lungene med den tilberedte sprøyten av agarose ved å injisere agarose manuelt via luftrørets kanyle med en hastighet på ca. 40 ml / min, bare til de mest distale spissene på lungelobene er oppblåst. Hvis distale lungeregioner forblir kollapset, injiser ytterligere 1-2 ml agarose. Cap luftrøret ved å feste den hvite hetten fra en 4-veis stoppekran til den kvinnelige luer-låsen på trakealkanylen. Legg lungen i en 150 mm Petri-tallerken på isen slik at agaroseen kan størkne.MERK: Inflasjonen i lungen kort tid etter utvinning er avgjørende for å sikre jevn fylling av lungeparenchyma, og etterfølgende vellykket vevsslicing. Hvis lungen blåser opp veldig ujevnt, må du ikke fortsette med lungeslicing, da skivekvaliteten vil være dårlig. Lunge kuttingMERK: Nøyaktig kuttingsprosedyre må kanskje tilpasses basert på den vibratoriske mikrotomen (vibratom) som brukes; ytterligere eksempler på PCLS-forberedelse med ulike vevsskiver har blitt publisert tidligere 32,33,34. Forkjøl metallkjøleblokken ved -20 °C og hold den på is når den ikke brukes gjennom skjæreprosedyren. Bruk en liten dråpe cyanoacrylatlim for å feste et blad til bladholderen. Fest knivholderen forsiktig til vibratomet ved hjelp av en unbrakonøkkel slik at den bare stemmer i forhold til enden av et prøverør som er satt inn i bufferbrettet. Forbered 6-brønnsplater med 3 ml per godt sterile iskalde HBSS uten fenolrød for å samle skivene. Bruk en skalpell, kutt et stykke lungevev ca 1-1,5 cm3.MERK: Lungevev fra nedre og midtre del av venstre lobe, samt fra høyre midtre og nedre lober, gir lettest større vevsskiver som maksimerer alveolarområdet. Hvis uoppblåste vevsregioner eller områder av bindevev er til stede, kan du enten trimme av dette vevet med saks eller orientere seg nedover mot stempelet; slikt vev har en tendens til ikke å kutte rent. Legg en liten dråpe cyanoacrylatlim på stempelet på prøverøret. Dab lungevev på en papirserviett for å fjerne overflødig fuktighet, og plasser deretter umiddelbart lungevevet på toppen av stempelet ved hjelp av et par tang. Skyv metallrøret på prøverøret opp til nivået på toppen av vevet og hold det på plass, med stempelet trukket tilbake. Pipette forvarmet 2% agarose i HBSS inn i toppen av røret for å fullstendig omgi vevet. Plasser den iskalde kjøleblokken rundt vevet i ca. 1 min for å la agarose størkne. Sett prøverøret inn i bufferskuffen. Fyll brettet med iskald PBS for å halvveis opp vevsblokken. Vri motorboksbryteren for å spole fremover (FF) for å flytte motorboksstempelet slik at det bare berører bunnen av prøverøret. Angi ønskede innstillinger for skjæretykkelse, skjærehastighet og oscillasjonsfrekvens, for eksempel 450 μm tykkelse, hastighet 4 og oscillasjonsfrekvens 5. Velg Kontinuerlig modus, og vri deretter bryteren til På for å begynne å kutte. Når vevskiver faller inn i bufferbrettet, overfør dem til de tilberedte 6-brønnsplatene ved hjelp av en inokulerende løkke eller spatel. Slutt å kutte når ~ 2 mm tykkelse av vev forblir i prøverøret, for å unngå å skade bladet eller skjærevevet som inneholder lim. Gjenta trinnene ovenfor for å kutte ekstra lungevev, etter ønske. Decellulariser skiver umiddelbart for stillasforberedelse, eller snap-frys og oppbevar ved -80 °C i opptil 2 måneder. For å fryse, overfør 4-6 skiver til en 35 mm Petri-tallerken og aspirer forsiktig overflødig væske fra rundt skivene. Legg oppvasken i et bad med tørris og 100% etanol for å snap-fryse, pakk deretter inn folie, tetning i en plastpose og overfør til -80 °C.MERK: Ikke plasser ferske skiver direkte i en -80 °C fryser, da den relativt langsomme frysehastigheten kan føre til at det dannes iskrystaller som kan skade vevet. 3. Forberedelse av lungevev stillaser Utarbeidelse av materialer og decellulariseringsløsninger Autoklaver rammer, utklipp og faner. Klargjør decellulariseringsløsninger som beskrevet i tabell 1.MERK: Tilsett benzonasekjernen i forvarmet buffer umiddelbart før bruk og sterilt filter. Forbered Triton X-100 og natrium deoxycholate (SDC) løsninger innen 24-48 h av decellulariseringsprosedyren. Forbered antibiotika/antimykotiske løsninger og benzonasebuffer opptil 30 d på forhånd og oppbevar ved 4 °C. Kutting og klipping av lungeskiverMERK: Mens kutting og klipping kan gjøres ikke-sterilt på benken, må avkalkingstrinnene i avsnitt 3.3 og all etterfølgende håndtering av vevsstillasene utføres i en laminær strømningshette. Fyll en 100 mm Petri-tallerken omtrent en tredjedel full med PBS. Overfør kassetter (rammer som inneholder to klips hver) og tappene til parabolen ved hjelp av tang. Hvis du bruker frosne skiver, tin en tallerken om gangen ved å helle romtemperatur PBS i parabolen for å dekke skivene. Hold gjenværende retter på tørris. Overfør en tint skive til en 150 mm Petri-tallerken. Brett forsiktig ut skiven ved hjelp av fine tang, om nødvendig, slik at den ligger flatt, og aspirer deretter forsiktig overflødig PBS fra rundt vevet. Bruk et barberblad, med en linjal som føring, til å kutte en 3 mm bred stripe fra skiven ved å trykke hele lengden på bladet godt mot parabolen og gynge det litt fra side til side med bladkanten holdt på plass. Alternativt kan du bruke en roterende kutter ettermontert med 2 parallelle kniver atskilt med en 3 mm skreddersydd avstandsstykke (f.eks. laget av acetal [polyoksymetylen]) for å kutte vevsstrimler. Unngå rifter, hull, store luftveier eller kar eller tykt bindevev.MERK: For vellykket klipping må stripen være minst 9 mm lang. Bruk tang, overfør vevsstripen til den tilberedte 100 mm Petri-parabolen. Klipp vevsstripen inn i kassetten: flyt vevet over kassetten, sentrert vevet for å overhenge hullene i klipsene i hver ende. Med fine tang plasserer du en fane delvis i hullet i den ene enden, retter forsiktig vevet og plasserer deretter den andre fanen. Bruk tang i hver hånd, trykk hver fane helt inn for å sikre vevet.MERK: Hvis du har problemer med å holde vevet på plass før klipping, aspirerer du litt PBS fra parabolen for å senke væskenivået. Pass på at du ikke strekker vevet i å plassere det andre klippet, da dette kan føre til riving. Gjenta opptinings-, skjære- og beskjæringsprosedyren i trinn 3.2.2-3.2.6 for så mange vev som ønsket. Decellularisering av stykke Når alle skiver er klippet, overfør den 100 mm parabolen som inneholder kassettene til en laminær strømningshette. Start trinn 1 i decellulariseringsprotokollen (se tabell 2): Bruk en buet hemostat til å gripe de hakkede sidene av hver kassett, overfør kassetter til 6-brønnsplater (2 vev/brønn) fylt med 3 ml PBS + ioner + antibiotika/antimykotika per brønn (se løsningsoppskrift i tabell 1). Plasser brønnplater på en orbital shaker ved 30 rpm i 10 min. Fortsett med trinn 2 i decellulariseringsprotokollen (se tabell 2): Aspirer væsken fra hver brønn, erstatt deretter med 3 ml / brønn PBS + ioner, plasser platen på orbital shaker ved 30 rpm, og inkuber i 5 minutter. Gjenta trinn 3.3.4 for hver av løsningene og tilsvarende varigheter som beskrevet i decellulariseringsprotokollen i tabell 2. Etter det siste skylletrinnet med PBS + antibiotika/antimykotika (trinn 20 i tabell 2), overfør vev til sterile 6-brønnsplater med fersk PBS + antibiotika/antimykotika, og inkuber ved 37 °C i 48 timer.MERK: Etter sterilisering med antibiotika/antimykotika kan stillaser i lungevev frøs umiddelbart, eller lagres ved 4 °C i opptil 30 d. 4. Skjær recellularisering og kultur MERK: Figur 2 viser en foreslått tidslinje for vevssåing og kultur, der skiver blir sådd først med rotte lungemikrovaskulære endotelceller og dyrket i lavserum endotelial medium; deretter frø med rotte AEC2s og rotte lungefibroblaster med et serumfritt AEC2 vekstmedium (tilpasset fra Jacob et al.13 og You et al.35); Se flere merknader om cellekilder som brukes i Resultater og mediedetaljer for kultur i tabell 3. Denne strategien gir alveolarlignende strukturer som inneholder AEC2 monolayers. Forbereder vevstillaser for såing (dag -4 eller -3) Hvis du bruker vevstillaser lagret ved 4 °C, inkuberer du stillaser over natten ved 37 °C med fersk PBS + antibiotika/antimykotika (10 % penicillin/streptomycin, 4 % amfotericin B, 0,4 % gentamicin i PBS) før sådd. Skyll stillasene 3x med steril PBS (5 ml/brønn), 5 min hver. Undersøk stillaser under et fasekontrastmikroskop ved 5x forstørrelse for å velge vev for såing.MERK: De beste stillasene for såing har ingen tårer eller hull og inneholder ikke store luftveier eller kar. Mens stillaser med funksjonene kan bli sådd vellykket, kan repopuleringsmønstre avvike fra de som observeres i alveolarområder. Endotelcelle såing (dag -3) Tell endotelceller ved hjelp av et hemocytometer og klargjør endotelcelleopphenget i endotelmedium (se tabell 3) ved 5 x 106 celler/ml, med tilstrekkelige celler til å frø 500 000 endotelceller per stykke (f.eks. for 12 skiver, resuspend 6 x 106 celler i 1,2 ml mellomstore celler). Plasser autoklavede såddbad i 100 mm Petri-retter. Overfør skyllede stillaser opp ned til såddbad: Bruk en fin buet hemostat for å gripe en kassett ved de hakkede sidene, bruk en rett hemostat eller tang for å gripe den ene enden av kassetten (vær forsiktig så du ikke berører selve vevet) og snu, og ta deretter tak i kassetten igjen med spissene på den fine buede hemostaten via hullene langs de hakkede sidene, og plasser i et såingsbad godt. Gjenta for gjenværende kassetter.MERK: Når stillasene er riktig plassert, vil de være sentrert, opp ned, i bunnen av hver brønn. Trykk om nødvendig forsiktig ned på hjørnet av kassetten med spissene på en hemostat for å sikre at kassetten sitter flatt i brønnen. Feil sitteplasser i kassetten kan føre til dårlig vevssåing. Det er akseptabelt hvis brønnen inneholder en liten mengde PBS. Virvle den tilberedte cellefjæringen forsiktig for å blande, og bruk deretter en manuell pipette til pipette 100 μL celler direkte på toppen av hvert vev ved foten av brønnen, vær forsiktig så du ikke skader vevet med pipettespissen. Overfør frøvev til cellekulturinkubatoren ved 37 °C/5 % CO2. Etter 2 timer, tilsett 900 μL forvarmet kulturmedium til hver brønn ved hjelp av en manuell pipette, og gå deretter tilbake til inkubatoren. Hvis en kassett blir usett (flyter) ved tilsetning av medium, trykker du forsiktig ned på hjørnet av kassetten med pipettespissen slik at den ligger flatt i brønnen. Endre medium på dag -2. Fjern mediet ved å vippe Petri-parabolen og røre manuelt med en pipettespiss lett plassert i hjørnet av brønnen, for ikke å forstyrre kassetten. Erstatt med 1 ml friskt endotelmedium per brønn. AEC2 og Fibroblast såing og vev kultur (Dag 0) Tell AEC2s og fibroblaster ved hjelp av et hemocytometer. Forbered en 1:1 celle suspensjon av AEC2s og fibroblaster i AEC2 vekstmedium (epitelial base medium + AEC2 kosttilskudd; se tabell 3) ved 5 x 106 totale celler / ml, med tilstrekkelige celler til å frø 500 000 celler (250 000 AEC2s og 250 000 fibroblaster) per skive (f.eks. for 12 skiver, resuspend 3 x 106 AEC2s + 3 x 106 fibroblaster sammen i 1,2 ml medium). Pipette ut mediet fra hver brønn i såddbadet som beskrevet i trinn 4.2.6. Virvle den tilberedte cellefjæringen forsiktig for å blande, og rør deretter 100 μL celler direkte på toppen av hvert vev ved foten av brønnen.MERK: Det er akseptabelt hvis en liten mengde endotelmedium forblir i brønnen før AEC2/fibroblast sådd. Overfør frøvev til cellekulturinkubatoren ved 37 °C/5 % CO2. Etter 2 timer, tilsett 900 μL forvarmet AEC2 vekstmedium til hver brønn, og gå deretter tilbake til inkubator. Etter 24 timers kultur (dag 1) tilbereder du en 12-brønnsplate med 1 ml forvarmet AEC2 vekstmedium per brønn per kassett. Pipette 800 μL medium fra hver brønn i såddbadet. Fjern kassetter fra såddbadet: Ta tak i hver med en fin buet hemostat via hullene langs de hakkede sidene, overfør til en rett hemostat eller tang for å ta tak i kassetten i den ene enden og snu, bruk deretter den buede hemostaten til å gripe kassetten via de hakkede sidene og overføre høyre side opp, en per brønn, til den forberedte 12-brønnsplaten. Bytt kulturmedium i 12-brønnsplaten annenhver dag til dag 7 eller for ønsket kulturlengde: Bruk en glass Pasteur pipette for å aspirere mediet fra hver brønn, vær forsiktig så du ikke berører vevet; pipette i 1 ml fersk AEC2 vekstmedium per brønn.MERK: Graden av vevsrepopulering kan overvåkes via fasekontrastmikroskopi ved 5x forstørrelse gjennom hele kulturens varighet. 5. Vevshøsting og prøveanalyse For å fikse ELT-er for histologi og immunfluorescerende farging, overfør vevskulturkassetter til 10% nøytralbufret formalin og inkuber i 3-4 timer ved romtemperatur på en rocker. Fjern vev fra kassetter ved å bruke spissen av en finspisset tang for å kutte vevet der det møter tappene. Prosessvev i henhold til rutinemessige metoder for parafininnbygging og histologi; Ingen spesialiserte teknikker er nødvendig. For å behandle ELLIS for qRT-PCR, skyll vev i kassetter i PBS 2x, fjern deretter vev og trykk frysing eller fortsett med lysis for RNA-ekstraksjon.MERK: Sammenslåing av minst 2 skiver frøet med 1 x 106 celler og dyrket i 7 dager bør gi rikelig RNA for nedstrøms PCR-analyse.

Representative Results

En oversikt over prosessen med å generere ELT-er – bestående av lungeslicing, skiveklipping og decellularisering, og stillasrepopulering – presenteres i figur 3. ELT-ene som presenteres her ble dyrket ved hjelp av primærrotte lungemikrovaskulære endotelceller (se Materialfortegnende bord), neonatalrotte AEC2s og lipofibroblastberiket neonatal rotte lungefibroblaster36. AEC2s ble fersk isolert via magnetisk perlebasert sortering som tidligere beskrevet37; alternative isolasjonsprotokoller er detaljert og diskutert andre steder 38,39,40. Renhet av isolert rotte AEC2s kan vurderes via strømningscytometri for rottespesifikk AEC2 overflatemarkør RTII-7041, eller ved farging av en cytocentrifuged celleprøve for RTII-70 eller pro-surfaktantprotein C (pSPC). Rotte lungefibroblaster ble isolert fra barseldag 7-9 rottepupper i henhold til en tilpasning av en publisert protokoll42 og brukt ved passasje 1-2; alternative isolasjonsprotokoller er beskrevet andre steder 43,44. Renhet av isolerte fibroblaster kan vurderes ved farging av dyrkede eller cytocentrifuged celler for mesenchymal markør vimentin, og lipofibroblast berikelse kan vurderes via farging for Olje Rød O45. Når lungevevet er jevnt oppblåst med agarose, og vevstykker strategisk valgt og orientert for kutting for å maksimere totalt og parenchymalt vevsområde, kan en rotte lunge gi vev for >100 alveolar ELTs. Strimler av PCLS har tilstrekkelig mekanisk integritet til å bli klippet inn i vevskassetter med få (<5%) tilfeller av rive (figur 3B). Protokollen for decellularisering av lungeskiver er nært basert på vår tidligere publiserte hele lungedecellulariseringsprotokoll, som ved kvantitativ proteomikk ble demonstrert for å bevare mange ECM-komponenter på nivåer som ikke er vesentlig forskjellig fra de i innfødt lunge22. Decellulariserte skivestillaser bevarer alveoliens opprinnelige arkitektur, sett av hematoksylin- og eosinfarge (H&E) (figur 4A, B) og ved fasekontrastmikroskopi (figur 4C). Vi utelukker vanligvis stillaser som inneholder store luftveier eller kar (figur 4D) eller tårer, selv om førstnevnte kan inkluderes hvis de er av interesse for forskeren. Decellularisering fører til en 96% reduksjon i vev DNA-innhold målt ved en analyse for dobbeltstrenget DNA (se Tabell over materialer; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs. 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg i innfødt vs decellularisert vev, henholdsvis gjennomsnittlig ± SEM) (figur 5A), uten DNA synlig ved hematoksylinfarging (figur 4B). Histologisk og immunfluorescerende farging av decellulariserte stillaser avslører vedlikehold av ECM-proteiner kollagen, elastin, kollagen IV og laminin med arkitektur og mengde som ligner på det i innfødte lungeskiver (figur 5B-E). Vær oppmerksom på at kjernen i innfødt vev flekker blått/svart med trichome (for kollagen) og EVG (for elastin) flekker. Immunfluorescerende farging ble utført som beskrevet tidligere, ved hjelp av standardmetoder for farging av vev37. Antistoffene som brukes og deres respektive konsentrasjoner er oppført i tabell 4. Vellykket repopulering av stillas fører til svært cellulære ELT-er etter 7 dager, med et alveolarlignende repopuleringsmønster synlig ved lysmikroskopi (figur 6A-C). I noen tilfeller, med svært høy cellulæritet, kan organoid-type strukturer være synlige (figur 6A, B). Mislykket vevssåing kan visualiseres ved fasekontrastmikroskopi under kultur (figur 6C). Etter å ha dyrket vevstillaser med AEC2s, fibroblaster og endotelceller, blir ELT-er tett repopulert med alveolarlignende strukturer som består av alle tre celleforingene (figur 6D, E). På dag 7 eller 8 opprettholder AEC2s cuboidal morfologi og uttrykker overflateaktivt protein-B (SPB) og lamellar kroppsprotein ABCA3, uten tegn på betydelig differensiering til AEC1s (figur 6E, F). AEC2s er svært proliferative i ELTs, som demonstrert av 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) inkorporering etter en 2 h puls ved 10 μM (figur 6G). Figur 1: Skjematisk perfusjonssystem for lungeutvinning og rydding. (A) Perfusjonssystemet består av en tyngdekraftsdrevet lem, som brukes til innledende kanalisering av lungearterien under strømning; pumpedrevet lem, som brukes til å fjerne lungene effektivt etter første kannasjon. Pumpeledningen inkluderer en “pulsdemper” som demper piggene i trykket forårsaket av pumpen. Utformingen av trakeale og lungearterielle kanyler er detaljert til venstre. SNP = natriumnittroprusside. (B) Detaljer om pulsdemperenhet. BPT og silikon refererer til typer rør. (C) Stillinger av trakeale og lungearterielle kanyler plassert under lungeutvinning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Kulturtidslinje for omforming av tri-lineage. Foreslått tidslinje for tri-lineage ELT-såing og kultur, inkludert tidspunkt for tofaset såing. Celletall for såing og kulturmedium for hver fase angis. Se detaljer om kulturmedier i tabell 3. AEC2 = alveolar epitelial type 2 celle. EC = endotelcelle. FB = fibroblast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Skjematisk av konstruert lungevevspreparat. (A) Innfødt lungevev kuttes i skiver ved hjelp av en vibratom. (B) Presisjonskuttede lungeskiver kuttes i standardiserte 3 mm brede strimler, klippes i polytetrafluoretylen (PTFE) vevskulturkassetter, og vaskemiddel-decellularisert for å gi acellulære ekstracellulære matrise stillaser. (C) Stillaser er reseeded i spesialiserte såing bad som begrenser såing området til området av vevet, og deretter dyrket i en standard brønnplate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Struktur av decellulariserte lungestillaser. H&E farging av innfødte (A) og decellulariserte (B) lungeskiver som viser bevaring av alveolararkitektur etter decellularisering. (C,D) Eksempler på decellulariserte ECM stillaser sett ved 5x forstørrelse ved fasekontrastmikroskopi, bestående av overveiende alveolarvev (C) eller inneholder store forgreningsveier og kar (D, svarte og røde pilspisser). Skalastenger, 50 μm (A, B); 500 μm (C, D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: DNA-fjerning og matriksbevaring i decellulariserte lungestillaser. (A) Kvantifisering av DNA i innfødte og decellulariserte lungeskiver (gjennomsnitt ± SEM, n = 5). Welch tester ikke , **P < 0,01. Decell = decellularisert. (B,C) Histologisk farging av innfødte og decellulariserte lungeskiver for kollagen (B) og elastin (C). Pilspisser, elastin bevart i alveolar inngangsringer av decellularisert vev. (D,E) Immunfluorescerende farging av innfødte og decellulariserte lungeskiver for kollagen IV (D) og laminin (E). Skalastenger, 50 μm. I alle paneler skisserer stiplede bokser bildeområdet som forstørres til høyre i hvert respektive panel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Cellulær repopulering av konstruert lungevev. (A-C) Eksempler på recellulariserte ELT-er på kulturdagen 7, som visualisert under kultur ved fasekontrastmikroskopi. Recellulariseringsmønsteret speiler vevets alveolarstruktur. I noen områder med høy cellulæritet kan organoidlignende strukturer dannes (pilspisser). (A) og (B) representerer vellykket cellerepopulering, mens (C) representerer et dårlig nivå av recellularisering etter 7 dager med kultur. (D-G) Farging av recellulariserte 1000-tallet på dag 7 eller 8 av kulturen. (D) H&E farging som viser cellulær repopulering av alveolar septa. (E) Immunofluorescent farging etiketter engrafted proCollagenIα1 + fibroblaster, ABCA3 + AEC2s, og CD31 + endotelceller. (F) Vev inneholder rikelig SPB + AEC2s, men få RTI-40 (podoplanin)+ AEC1s under disse forholdene. (G) Mange AEC2-er sprer seg i ELT-er, målt ved EdU-inkorporering. Skalastenger, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tabell 1: Decellulariseringsløsninger. Klargjøringsdetaljer for decellulariseringsløsninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 2: Decellulariseringsprotokoll. Detaljer om protokoll for decellularisering av lungeskiver. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 3: Kulturmedier. Forberedelsesdetaljer for endotel- og AEC2-vekstmedier. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 4: Antistoffer som brukes til immunstaining. Detaljer om antistoffer og deres konsentrasjoner som brukes til immunstaining. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tilleggsfil 1: Design for laserskjæring av vevskulturkassettrammer. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 2: Design for laserskjæring av vevskulturkassettklemmer. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 3: Design for laserskjæring vev kultur kassett faner. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 4: CAD-fil for såing bad mold base. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 5: CAD-fil for såing bad mold ring. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Dette papiret beskriver bruken av decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver som en plattform for å generere konstruert lungevev in vitro, som inneholder multi-lineage alveolar-lignende strukturer. Ved å kombinere strategier som vi tidligere utviklet for å repopulate high-fidelity acellular ECM lunge stillaser for hele lungeteknikk^22,31, med vårt robuste system for culturing småskala konstruert hjertevev³⁰, denne protokollen muliggjør bruk av fysiologisk relevant lunge ECM som vev kultur substrat, på en repeterbar og moderat gjennomstrømning måte.

Metodene som presenteres her beskriver ELT stillaspreparat fra rotte lunger, som er lett oppnåelige, kan ekstraheres en blokk med direkte tilgang til intakte luftveier for agarose inflasjon, og er av større størrelse enn musen lunge. Imidlertid kan ethvert lungevev som kan blåses opp med agarose og utbytteskiver minst 9 mm i lengde, brukes i dette systemet. Uavhengig av vevskilde er jevn inflasjon av lungevevet med agarose det mest kritiske trinnet for å sikre suksess med nedstrøms vevsskjæring, klipping og vevshåndtering. Underinflatert lungevev har en tendens til ikke å skjære rent, mens overinflatert vev kan rive under klipping. Etter agarose gelering er passende oppblåste vevsregioner faste, men gir litt gi når de trykkes forsiktig med tang. For intakte rotte lunger fant vi at forblåsing av ekstraherte lunger med luft flere ganger, etterfulgt av agarose inflasjon så snart som mulig etter utvinning, resulterer i de beste kutting utfall og beste kvalitet på resulterende vev stillaser. Riktig volum av agarose må optimaliseres empirisk; for en rotte lunge volumet som kreves for å blåse opp lungen til total lungekapasitet er ca 30 ml / kg dyremasse (f.eks. 10,5 ml agarose for lunger fra en 350 g rotte). For større resected lungevev med mindre grei luftveistilgang (for eksempel de fra menneskelige donorer), kan det være nødvendig med ytterligere feilsøking for å blåse opp vevet via en bronchus³². Under etterfølgende lungeslicing er utvelgelsen og orienteringen av vevet på stempelet et annet viktig skritt for å 1) sikre at skivene er store nok til å generere vevsstrimler som kan klippes inn i vevskulturkassetter og 2) maksimere parenchymalt (alveolar) vevsområde, unntatt store luftveier eller kar.

Klipping av PCLS i vevskulturkassetter kan være et utfordrende skritt i utgangspunktet, men kassettene forenkler vevshåndteringen sterkt under decellularisering og såing. To potensielle problemer som kan oppstå er vevsrivning (enten under klippingsprosessen eller under decellularisering), eller vevsposisjonering i klippene som resulterer i dårlig nedstrøms såing (f.eks. ingen såing eller såing bare i enden). Riving kan være et resultat av agarose overinflasjon, overstretching av vevet under tab innsetting, eller la for lite overheng for å gi tilstrekkelig vev grep når du setter inn tappene. Vær oppmerksom på at skiver som rives i den ene klipsenden kan bli vellykket frøet, men de er vanskelige å visualisere under mikroskopet under kulturen, da vevet ikke er flatt. Dårlig vevssåing (slik som i figur 6C) er sannsynligvis et resultat av at skiven ikke ligger flatt mellom de to klipsene, og dermed får dårlig kontakt med bunnen av såddet godt når det vendes opp-ned. En annen mulig årsak er feil sitteplasser på kassetten i bunnen av såddbadet godt. Når det gjelder klipping, bruk litt mer spenning i vevet når du plasserer det andre klippet for å hjelpe det å ligge flatt. Noen skiver har en liten konkavitet; I disse tilfellene klipper du stykket med den konvekse siden opp. Med praksis opplever vi vanligvis mislykket såing med færre enn 2% av skiver.

En begrensning i denne protokollen er kravet til noe spesialisert utstyr – en laserkutter og en 3D-skriver – for å generere de første materialene for ELT-forberedelse. Men når vevskulturkassettene og såddene er opprettet, er det ikke nødvendig med flere spesielle materialer. Lungeslicing og decellulariseringstrinn av ELT stillaspreparat er moderat tidkrevende; Disse trinnene kan imidlertid utføres på forhånd, eller i tall som er tilstrekkelige til å forberede seg på flere eksperimenter samtidig. Mange PCLS (>100 hvis optimalisering for parenchymale regioner) kan kuttes fra en enkelt lunge og snap-frozen for senere bruk. Mens en enkelt fryse-tine syklus kan forårsake mindre ultrastrukturelle skader på ECM⁴⁶, selv flere fryse-tine sykluser har vist seg ikke å forårsake et betydelig tap i ECM ^23,47. PCLS kan også klippes og decellulariseres i forkant av et eksperiment, som skal brukes innen en måned. (Spesielt kan den beskrevne decellulariseringsprotokollen utføres på omtrent 6 timer, noe som representerer en betydelig fordel i forhold til tidligere beskrevne metoder som krever en dag eller mer^27,28.) Når stillasene er forberedt, er cellesåingsprosessen enkel og rask, og kulturen til ELTs krever ikke spesialiserte teknikker.

En advarsel om den beskrevne ELT-metoden er mangelen på regionspesifikk såing, det vil si levering av AEC2s spesielt til alveolarrommet, eller endotelceller spesielt til det vaskulære rommet. Likevel, selv om celler bare er frøet på toppen av vevsstillasene, er mønsteret for recellularisering ikke-tilfeldig, med noe semblance av alveolarlignende organisasjon, inkludert epitelringer. Vi mistenker at cellecelleinteraksjoner, samt lokale forskjeller i ECM-sammensetning og geometri ^20,21, sannsynligvis bidrar til de observerte recellulariseringsmønstrene. Til støtte for denne hypotesen viste en tidligere publisert studie, der fibroblaster ble sådd ikke-spesifikt på decellulariserte lungeskiver, at mønsteret av vevsrepopulering og tilhørende cellulære fenotyper varierte betydelig etter mikroskopisk vevsregion og ECM stillaskilde (f.eks. sunn versus syk)²⁷. Fibroblaster ble også observert å invadere inn i interstitiumet – stedet der de bor i innfødt lungevev ^1,27. Den primære alternative metoden som vi kan forestille oss å dyrke celler på lungeskiver på en virkelig regionspesifikk måte, vil innebære såing intakte decellulariserte lunger via luftveiene^31,48 og vaskulære rom^49,50, og deretter kutte det recellulariserte vevet. Dette alternativet 1) er imidlertid betydelig mer kostnads-, tids- og ressurskrevende; 2) er lavere gjennomstrømning; 3) krever økt antall dyr; og 4) er forbundet med økt risiko for kontaminering på grunn av utfordringene i hele lungekulturen og påfølgende kutting av frø lungen. Selv om ELT-plattformen ikke rekapitulerer alle aspekter av innfødt cellulær organisasjon, muliggjør den lungecellekultur på et fysiologisk relevant ECM-substrat, på en måte som er tilgjengelig for mange flere laboratorier.

Fleksibiliteten til ELT-systemet er en stor fordel med denne plattformen, og bør tillate småskala lungevevskultur med et hvilket som helst antall vevstillaser, celler eller kulturmedier av interesse. Bruk av stillaser avledet fra sykt vev eller fra skademodeller kan tillate studiet av cellecelle- eller cellematriseinteraksjoner i innstillingen av sykdoms endret ECM 27,29,51. Vær imidlertid oppmerksom på at decellulariseringsprotokollen kanskje må tilpasses for å ta hensyn til matriseforskjeller mellom art⁵². Den beskrevne såingsstrategien kan brukes til alle celletyper, og kulturtidslinjen tilpasset forskerens behov. Som utgangspunkt bør 1 x 10⁶ celler per stillas gi et svært cellulært vev innen 7 dager etter kultur, mens 1 x 10⁵ totale celler resulterer i dårlig cellulæritet. I enhver tilpasning av tidslinjen skal vevskulturkassettene fjernes fra såddbadet 24 timer etter siste vevssåing. Her, med mål om å modellere noe av den cellulære kompleksiteten til lungealveolus, beskriver vi en tri-kultur recellulariseringsstrategi som støtter vedlikehold av godt differensierte neonatale AEC2s i alveolarlignende strukturer i minst 7 dager. Våre resultater viser også vellykket engraftment av både fibroblaster og endotelceller i ELTs, med vekt på den brede anvendbarheten av kultursubstratet og dets egnethet for samkulturstudier. Såing av voksne celler i ELTs kan lette modelleringen av mer quiescent alveolar strukturer, mens såing menneskelige PSC-avledede AEC2s, inkludert de med genetiske modifikasjoner, kan lette translasjonelle studier av menneskelig sykdom^13,53. Generelt presenterer den nedenfra-og-opp-tilnærmingen som er aktivert av ELT-plattformen muligheten til å undersøke bidragene fra bestemte celletyper til avlesninger av interesse – for eksempel AEC2-spredning eller differensieringstilstand.

Oppsummert skisserer denne protokollen et robust system for å generere konstruert lungevev for samkulturstudier av AEC2s, fibroblaster og endotelceller i acellulære ECM lungeskive stillaser. ELTs representerer en ny 3D-kulturstrategi for primære AEC2s, som til dags dato vanligvis har stolt på mindre fysiologiske gel-type matriser for å opprettholde en godt differensiert fenotype ^6,11,12. Den nåværende plattformen bygger på tidligere arbeid i repopulering av decellulariserte lungeskiver 24,25,26,27,28,29, men tilbyr flere fordeler: 1) et vevskulturkassettsystem for å lette ELT-håndtering under decellularisering, såing og kultur; 2) et tilpasset såddbad for å nøyaktig frø et kjent antall celler på hvert stykke stillas; og 3) en trekulturell reseeding strategi som muliggjør alveolar vev repopulation med epitelial, mesenchymal, og endotelceller. Dermed representerer ELTs et viktig skritt fremover mot å skape reproduserbare in vitro-modeller som fanger den cellulære og substratkompleksiteten til den innfødte alveolus og AEC2 stamcellenisjen.

Materials

3D Printer: Form 2	Formlabs
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I5879
8-Bromo cAMP	Sigma	B7880
Agarose, UltraPure LMP	Invitrogen	15517-014
Amphotericin B	Sigma	A2942
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch	McMaster-Carr	5121K271
Benzonase nuclease	Sigma	E1014
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	Gemini	700-104P	For AEC2 growth medium
Bovine serum albumin (BSA), standard grade	Gemini	700-100P	For benzonase buffer
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb	Cole-Parmer	SK-98553-10
CHIR99021	PeproTech	2520691
Clear Resin, 1 L	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue	Any hardware, craft, or drug store	KG483 or similar
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM (low glucose)	Gibco	11885-084
DMEM (high glucose)	Gibco	11965-092
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)	Invitrogen	P7589
EDTA, 0.5 M, pH 8.0	AmericanBio	AB00502-01000
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)	Invitrogen	C10340	Used according to manufacturer's directions
Elbow fitting, 3/8 inch	McMaster-Carr	5121K907
F12	Gibco	11765-054
Fetal bovine serum (FBS), characterized	Hyclone	SH30071.03
Gentamicin sulfate	Gemini	400-100P	Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL
Hair clippers	Wahl	MiniArco
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free	Gibco	14175-095
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL	Sagent	NDC: 25021-400-30	For intraperitoneal and intracardiac injection
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS
HEPES Buffer	Corning	25-060-Cl
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch	McMaster-Carr	5121K851
Inoculating loop, disposable	Fisherbrand	22-363-600
Insulin from bovine pancreas	Sigma	I6634
Ketamine injection, 100 mg/mL	Covetrus (Butler Animal Health)	010177
KGF, recombinant human	PeproTech	100-19
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt	Universal Laser Systems
L-glutamine	Gibco	25030-081
Luer-lock, female, 3/32 inch	Cole-Parmer	45508-02
Luer-lock, male, 1/8 inch	Cole-Parmer	30800-24
Luer-lock, male, 1/4 inch	McMaster-Carr	51525K146
MCDB-131 Complete without serum	VEC Technologies	MCDB-131 WOFBS
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M	AmericanBio	AB09006-00100
NaCl	American Bioananalytical	AB01915
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X	Sigma	D1408	Reconstitute to 1X with diH2O
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+	Gibco	21300-058
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	4019862
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin)	Gibco	15140-122
Petri dish, 150 mm	Falcon	351058
Plastic film (parafilm)	Bemis	PM-996
Pharmed BPT tubing, LS 16	Masterflex	06508-16
Pharmed BPT tubing, LS 17	Masterflex	06508-17
Platinum-cured silicone tubing, LS 14	Masterflex	96420-14
Platinum-cured silicone tubing, LS 16	Masterflex	96420-16
Platinum-cured silicone tubing, LS 36	Masterflex	96410-36
Poloxamer 407 (Pluronic F-127)	Sigma	P2443
Povidone/iodine prep pads, 10%	Dynarex Corporation	1108
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick	ePlastics	PTFENAT0.060X12X12	For tissue culture cassette tabs
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick	ePlastics	PTFENAT0.093X12X12	For tissue culture cassette frames and clips
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive	Cole-Parmer	ZM-07528-30
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	Cole-Parmer	EW-77202-60
Rat, Sprague Dawley	Charles River	Strain Code: 400
Razor blade	Any hardware or craft store	Personna 94-120-71 or similar
Retinoic acid	Sigma	R2625
Rotary blades, 28 mm	Omnigrid	2046
Rotary cutter, 28 mm	Olfa	Model 9551
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma	D6750
Sodium nitrorusside (SNP)	Sigma	71778
Stopcock, 4-way	Edwards	594WSC
Suture, 4-0 monofilament polypropylene	Covidien	VP-557-X
Syringe, 10 mL	BD	302995
Syringe, 50 mL	BD	309653
Tissue culture dish, 35 mm	Falcon	353001
Tissue culture dish, 100 mm	Corning	430167
Tissue culture plate, 6-well	Falcon	353046
Tissue culture plate 12-well	Falcon	353043
Transferrin human	Sigma	T8158
Tris, 1 M solution, pH 8.0	AmericanBio	AB14043-01000
Triton X-100	American Bioanalytical	AB02025-00500
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z	Precisionary Instruments LLC
Xylazine, 100 mg/mL	Henry Schein	NDC: 11695-4022-1
Y-connector, 1/16 inch barbed	Cole-Parmer	30614-43