Summary
Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.
Abstract
Çeşitli bakteri türleri, lipitler, proteinler, nükleik asitler, glikanlar ve ebeveyn hücrelerden türetilen diğer moleküllerden oluşan ~ 20-300 nm hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılar. EV'ler, türler arası ve türler arası iletişim vektörleri olarak işlev görürken, aynı zamanda enfeksiyon ve kolonizasyon bağlamında bakteri ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşime katkıda bulunur. Sağlık ve hastalıkta EV'lere atfedilen çok sayıda fonksiyon göz önüne alındığında, EV'leri in vitro ve in vivo çalışmalar için izole etmeye yönelik artan bir ilgi vardır. EV'lerin fiziksel özelliklere, yani boyuta göre ayrılmasının, veziküllerin çeşitli bakteri kültürlerinden izolasyonunu kolaylaştıracağı varsayılmıştır.
İzolasyon iş akışı, EV'lerin bakteri kültürlerinden izolasyonu için santrifüjleme, filtreleme, ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisinden (SEC) oluşur. Ölçeklenebilirliği artırmak için pompa tahrikli teğetsel akış filtrasyonu (TFF) adımı dahil edildi ve malzemenin litre başlangıç hücresi kültüründen izole edilmesini sağladı. Escherichia coli , EV ile ilişkili nanolusiferaz ve EV ile ilişkili olmayan mCherry'yi muhabir proteinler olarak ifade eden bir model sistem olarak kullanılmıştır. Nanolusiferaz, N-terminusunu sitolisin A ile kaynaştırarak EV'lere hedeflendi. İlişkili sitolisin A - nanoLuc ile ilişkili 20-100 nm EV'ler içeren erken kromatografi fraksiyonları, serbest proteinleri içeren daha sonraki fraksiyonlardan farklıydı. EV ile ilişkili nanolusiferazın varlığı, immünogold etiketleme ve transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulandı. Bu EV izolasyon iş akışı, diğer insan bağırsağı ile ilişkili gram-negatif ve gram-pozitif bakteri türlerine uygulanabilir. Sonuç olarak, santrifüjleme, filtrasyon, ultrafiltrasyon / TFF ve SEC'nin birleştirilmesi, EV'lerin çeşitli bakteri türlerinden ölçeklenebilir izolasyonunu sağlar. Standartlaştırılmış bir izolasyon iş akışının kullanılması, türler arasında mikrobiyal EV'lerin karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EV'ler), hem prokaryotik hem de ökaryotik hücreler tarafından salgılanan lipitler, proteinler, glikanlar ve nükleik asitlerden oluşan nanometre boyutunda, lipozom benzeri yapılardır1. EV'lerin gram-negatif bakterilerden salınımını görselleştiren ilk çalışmalardan bu yana, bakteriyel EV'lere (çapı 20-300 nm) atfedilen biyolojik fonksiyonların sayısı son yıllarda sürekli artmaktadır. İşlevleri arasında antibiyotik direncinin aktarılması3, biyofilm oluşumu4, çekirdek algılama5 ve toksin dağıtımı6 bulunur. Bakteriyel EV'lerin terapötik olarak kullanılmasına, özellikle aşıbilimi 7 ve kanser tedavisi8'de artan bir ilgi vardır.
EV araştırmalarına artan ilgiye rağmen, izolasyon yöntemleriyle ilgili hala teknik zorluklar var. Spesifik olarak, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve çeşitli EV üreten organizmalarla uyumlu izolasyon yöntemlerine ihtiyaç vardır. EV izolasyonu ve araştırma yöntemlerini planlamak ve raporlamak için birleşik bir ilkeler kümesi oluşturmak için, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği, MISEV pozisyon makalesi9'u yayınlar ve günceller. Ayrıca, EV-TRACK konsorsiyumu, şeffaflığı artırmak için yayınlanan makalelerde kullanılan EV izolasyonu için ayrıntılı metodolojileri raporlamak için açık bir platform sağlar10.
Bu protokolde, EV'lerin memeli hücre kültüründen izolasyonu için kullanılan önceki metodolojiler, EV'lerin bakteriyel hücre kültüründen izole edilmesini sağlamak için 11,12 uyarlanmıştır. Ölçeklenebilir olabilen çeşitli mikroplardan EV izolasyonunu sağlayan ve EV saflığını ve verimini dengeleyen yöntemler kullanmaya çalıştık (MISEV pozisyon kağıdı9'da tartışıldığı gibi). Santrifüjleme ve filtreleme yoluyla bakteri hücrelerini ve kalıntıları temizledikten sonra, kültür ortamı ya santrifüj cihazı ultrafiltrasyonu (~ 100 mL'ye kadar bir hacim için) veya pompa tahrikli TFF (daha büyük hacimler için) ile konsantre edilir. EV'ler daha sonra küçük EV'lerin saflaştırılması için optimize edilmiş sütunlar kullanılarak SEC tarafından izole edilir.
Şekil 1: Bakteriyel EV izolasyonu iş akışı şemasına genel bakış. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; TFF = teğetsel akış filtrasyonu; SEC = boyut dışlama kromatografisi; MWCO = moleküler ağırlık kesme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Escherichiacoli'nin bir fare-kommensal suşu (yani, E. coli MP113) model bir organizma olarak kullanılmış ve daha önce bildirildiği gibi sitolisin A'ya füzyon yoluyla EV-ilişkili nanolusiferazı eksprese etmek için modifiye edilmiştir14. Burada kullanılan yöntemler, en az birkaç litreye kadar bakteri kültürünü işleyebilir ve EV ile ilişkili olmayan proteinleri etkili bir şekilde ayırabilir. Son olarak, bu yöntem diğer gram-pozitif ve gram-negatif bakteri türleri için de kullanılabilir. Bildirilen deneylerin ilgili tüm verileri EV-TRACK bilgi tabanına (EV-TRACK ID: EV210211)10 sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bakteri ve rekombinant DNA içeren tüm çalışmaların, her suşun biyogüvenlik tehlike seviyesine uygun biyogüvenlik muhafazası için en iyi uygulamaları takip ettiğinden emin olun. Çalışmalar yerel, ulusal ve uluslararası biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak yapılmalıdır.
1. Bakteri suşları ve kültürleme koşulları
NOT: Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ve Bifidobacterium dentium idi.
- E. coli için, tek kolonileri 250 ila 1.000 mL Luria-Bertani (LB) suyuna aşılamak için steril bir döngü kullanın ve kültürü işlemeden önce 48 saat boyunca 300 rpm ve 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde aerobik olarak inkübe edin. P114-mCherry-Clyluc (Ek Yöntem ve Ek Şekil S1) barındıran rekombinant E. coli MP1 suşu için, LB agarına kloramfenikol ve et suyuna 17 μg / mL'lik son konsantrasyonda ekleyin.
- A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve ve B. dentium için, Beyin kalp infüzyonu (BHI) agar plakalarına çizgi çizin ve vinil anaerobik bir odanın içinde anaerobik olarak inkübe edin. Tek kolonileri 100 mL önceden indirgenmiş BHI suyuna aşılayın ve anaerobik olarak 48 saat boyunca inkübe edin.
2. EV izolasyonu
- Santrifüjleme ve filtrasyon ile bakteri kültürü ortamının berraklaştırılması
- 250 mL veya 500 mL polipropilen santrifüj şişelerini dökerek temizlemek için adım 1'de aşılanan bakteri hücre kültürlerini aktarın. Şişeleri 4 °C'de ve 5.000 × g'da 15 dakika boyunca büyük kapasiteli, sabit açılı bir rotorda santrifüj edin. Süpernatantı dikkatli bir şekilde dökerek temiz santrifüj şişelerine aktarın ve 15 dakika boyunca 10.000 × g'da tekrar santrifüj yapın.
NOT: Biyogüvenliğe uygun temizlik ve dekontaminasyondan sonra şişeleri tekrar kullanın.- İkinci santrifüjlemeden sonra büyük bakteri hücresi peletleri varsa, hücreleri daha fazla çıkarmak için santrifüjlemeyi temiz bir şişede tekrarlayın.
- Süpernatantı dökerek uygun boyutta 0,22 μm polietersülfon vakumla çalışan filtre cihazına aktarın. Filtreleme cihazını bir vakum duvarı beslemesine bağlayarak filtreleyin. Filtreleme hızı önemli ölçüde düşerse, filtrelenmemiş herhangi bir malzemeyi yeni bir cihaza taşımanız yeterlidir. Filtrelenmiş ortamı gece boyunca 4 ° C'de saklayın ve istenirse ertesi gün protokole devam edin.
NOT: Yukarıdaki santrifüjlemeler tipik olarak her bir cihazdan belirtilen hücre kültürü hacminin ~2 katının işlenmesine izin verir. Örneğin, tek bir 500 mL filtre cihazı, ~ 1.000 mL önceden santrifüj edilmiş kültürü filtreleyebilir. Bu aygıtlar genellikle yeniden kullanılmaz. Bu adımda şırınga filtrelerinin kullanılması, test edilen modellerde önemli kayıplar kaydedildiğinden, optimizasyon olmadan önerilmez. Bu potansiyel bir durma noktasıdır. - Bu noktada, filtrelenmiş süpernatantın bir alikotunu uygun agar plakalarına yayarak canlı hücrelerin tamamen çıkarılmasını kontrol edin ve bakteri suşu için optimum koşullarda inkübasyondan sonra herhangi bir koloninin bulunmadığından emin olun. Bakteri tespit edilirse, ek santrifüjlemeler ve / veya filtrelemeler yaparak yukarıdaki prosedürü daha da optimize edin.
- 250 mL veya 500 mL polipropilen santrifüj şişelerini dökerek temizlemek için adım 1'de aşılanan bakteri hücre kültürlerini aktarın. Şişeleri 4 °C'de ve 5.000 × g'da 15 dakika boyunca büyük kapasiteli, sabit açılı bir rotorda santrifüj edin. Süpernatantı dikkatli bir şekilde dökerek temiz santrifüj şişelerine aktarın ve 15 dakika boyunca 10.000 × g'da tekrar santrifüj yapın.
- Filtrelenmiş ortamın konsantrasyonu
- Önemli ölçüde >100 mL hacimlerle çalışıyorsanız, adım 2.2.2'ye geçin. ~100 mL'lik hacimlerle çalışıyorsanız, serolojik pipetler kullanarak ilgili kapasiteli 100 kDa moleküler ağırlıklı kesme (MWCO) santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazının rezervuarına 90 mL filtrelenmiş kültür ortamı yükleyin. Her zaman eşleşen bir ultrafiltrasyon cihazı ile dengeleyin ve üst rezervuardaki ortamın hacmi 0,5 mL'ye konsantre olana kadar 15-30 dakikalık aralıklarla 4 °C ve 2.000 <× g'de sallanan kova rotorunda santrifüj yapın.
- Rezervuarı kalan filtrelenmiş kültür ortamıyla doldurun. "Yükleniyorsa", cihazın altındaki akışı kaldırın ve tüm cihazları yeniden dengeleyin.
NOT: Bu cihazlar kullanılarak konsantre edilebilen filtrelenmiş kültür ortamının maksimum hacminin, önerilen hacmin <2 katı olduğu gözlenmiştir. - Rezervuardaki konsantre ortamın viskozitesi gözle görülür şekilde artarsa (koyu, viskoz malzeme), fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin ve 100 kDa'lık MWCO'dan daha küçük EV olmayan proteinleri seyreltmek için santrifüjleme ile yeniden konsantre edin.
NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır. - Konsantre ortamı düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın, gece boyunca 4 ° C'de saklayın ve istenirse ertesi gün protokole devam edin.
- Rezervuarı kalan filtrelenmiş kültür ortamıyla doldurun. "Yükleniyorsa", cihazın altındaki akışı kaldırın ve tüm cihazları yeniden dengeleyin.
- Önemli ölçüde 100 mL'> hacimlerle çalışıyorsanız, işlenecek hacme uyum sağlamak için uygun boyutta bir TFF cihazı (100 kDa MWCO) seçin.
NOT: 100 mL ila >1.000 mL işleme için filtreleme cihazları piyasada mevcuttur. Yerel kullanılabilirlik, maliyet ve pompa ve boru/bağlantılarla uyumluluk, hangi modellerin en kullanışlı olacağını belirleyecektir. Filtrenin temizlenmesi gerekmeden önce Malzeme Tablosunda belirtilen cihazla 2 L'ye kadar kültür ortamı işlenmiştir (temizleme protokolü için aşağıdaki adım 2.3'e bakın).- Ek Şekil S2'de belirtildiği gibi, #16 düşük bağlayıcı/düşük liç borusu, Luer adaptörlerine, TFF cihazına ve peristaltik pompaya 1/8 inç hortum dikenli bir filtreleme devresi monte edin.
NOT: EV preparatının çevresel bakterilerle kirlenme riskini en aza indirmek için TFF'yi bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin. - Oda sıcaklığında, filtrelenmiş, şartlandırılmış ortamı yaklaşık 200 mL / dak'da (minimum 100 mL / dak) dolaştırmaya başlayın. Dereceli bir kaba 200 mL PBS pompalayarak istenen akış hızına karşılık gelen uygun RPM'yi belirleyin. Filtrelenmiş, şartlandırılmış ortamı dolaştırırken, ultrafiltrasyon membranını geçen <100 kDa molekülleri ayrı bir kapta atık olarak toplayın.
NOT: Aşağıdaki örnekte 2 L'lik bir kültür başlangıç hacmi varsayılmıştır. - Hacmi ~ 100-200 mL'ye düşene kadar şartlandırılmış ortamı dolaştırmaya devam edin. Gerektiğinde daha küçük gemilere geçin. PBS ile 2 kat seyreltin ve 75-100 mL'ye kadar konsantre olarak pompa ile dolaşmaya devam edin. PBS ile 2 kat seyreltin ve 25 mL'lik son bir hacme kadar dolaşmaya devam edin. PBS ile 2 kat seyreltin ve <10 mL'ye kadar dolaşmaya devam edin.
- Besleme borusunu numune haznesinden kaldırın ve filtreyi boşaltmak ve maksimum numune miktarını geri kazanmak için pompalamaya devam edin.
NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır. - Konsantre numuneyi konik bir tüpe aktarın ve istenirse gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, protokolle devam edin.
- Konsantre numuneyi 15 mL kapasiteli 100 kDa MWCO santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazına taşıyın. Üst rezervuardaki ortamın hacmi ×2 mL'ye konsantre olana kadar 15-30 dakikalık aralıklarla 4 °C ve 2.000 < g'da sallanan bir kova rotorunda santrifüj.
NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır. - Konsantre ortamı düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın, istenirse ertesi gün protokole devam edin.
- Ek Şekil S2'de belirtildiği gibi, #16 düşük bağlayıcı/düşük liç borusu, Luer adaptörlerine, TFF cihazına ve peristaltik pompaya 1/8 inç hortum dikenli bir filtreleme devresi monte edin.
- Önemli ölçüde >100 mL hacimlerle çalışıyorsanız, adım 2.2.2'ye geçin. ~100 mL'lik hacimlerle çalışıyorsanız, serolojik pipetler kullanarak ilgili kapasiteli 100 kDa moleküler ağırlıklı kesme (MWCO) santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazının rezervuarına 90 mL filtrelenmiş kültür ortamı yükleyin. Her zaman eşleşen bir ultrafiltrasyon cihazı ile dengeleyin ve üst rezervuardaki ortamın hacmi 0,5 mL'ye konsantre olana kadar 15-30 dakikalık aralıklarla 4 °C ve 2.000 <× g'de sallanan kova rotorunda santrifüj yapın.
- TFF cihazının temizlenmesi (opsiyonel)
NOT: TFF cihazı işlem sırasında "tıkanmaya" başladığında filtrasyon hızı azalır (kirlenme). Gerekirse, aynı saflaştırma çalışmasında ek numunelerin filtrelenmesini kolaylaştırmak için filtre cihazı temizlenebilir. Teorik olarak mümkün olmasına rağmen, çapraz kontaminasyonu önlemek için farklı bir arıtma işlemi için temizlenmiş bir TFF filtresi kullanılmamıştır.- Temizlemek için, TFF cihazındaki tüm boruları ve kapakları çıkarın ve kalan sıvıyı boşaltın.
- TFF cihazının hem iç hem de dış bölmelerini (yani, Malzeme Tablosunda listelenen modeldeki paralel ve dik portlar aracılığıyla) ~ 100 mL damıtılmış su ile doldurmak için peristaltik pompayı ve boruyu kullanın. Tüm boruları/kapakları çıkarın ve TFF cihazını boşaltın.
- Dış (dik, filtrat) portları kapatın ve 250 mL'lik %20 etanolün damıtılmış suda >200 mL/dak'da iç bölmeden 10 dakika boyunca dolaştırın. Boşaltın, damıtılmış suyla su basın ve yukarıdaki gibi tekrar boşaltın.
- 250 mL 0,5 N taze NaOH çözeltisini iç bölmeden 30 dakika boyunca dolaştırın ve tekrar boşaltın.
- Ek Şekil S2'de olduğu gibi tüm boru ve kapakları giriş, çıkış ve filtreleme portlarına yeniden bağlayın ve 1 mL/cm2filtre yüzey alanı hacmindeki bir hacim filtre membranına nüfuz edene ve filtrat / atık olarak toplanana kadar 0,5 N NaOH çözeltisini tekrar >.
- TFF cihazını yukarıdaki gibi damıtılmış su ile durulayın. TFF cihazını hemen kullanın veya cihazı ~ 100 mL% 20 etanol ile doldurun ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
NOT: Etanolde depolanmışsa, >1 mL/cm2 hacimli bir filtre yüzey alanı filtre membranına nüfuz edene ve numune işlemeden önce artık etanolün giderilmesi için filtrat/atık olarak toplanana kadar250 mL PBS'yi boşalttığınızdan, suyla duruladığınızdan, boşalttığınızdan ve cihazdan sirküle ettiğinizden emin olun.
- Boyut hariç tutma kromatografisi (SEC)
NOT: SEC, EV'lerin saflığını arttırmak ve veziküler olmayan proteini uzaklaştırmak için kullanılır.- EV'lerin <100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için küçük bir SEC sütunu (10 mL yatak hacmi) ve EV'lerin >100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için daha büyük bir sütun (47 mL yatak hacmi) kullanın.
NOT: Aşağıdaki örnekte, daha büyük sütunun hacimleri, küçük sütunun hacimleri parantez içinde listelenecektir. - SEC sütununu ve PBS'yi birkaç saat içinde oda sıcaklığına getirin. Standart bir laboratuvar standı ve tutucu kullanarak SEC kolonunu dikey konumda stabilize edin. Alternatif olarak, ticari kromatografi sütun standları kullanın.
- SEC sütununa bağlanmadan önce, 5 mL PBS'nin fritten ve bir atık kabına akmasına izin vererek numune haznesini nemlendirin. SEC sütununun giriş kapağını sökün, numune haznesine 2 mL PBS ekleyin ve PBS fritten damlarken rezervuarı dikkatlice kolona bağlayın (küçük SEC sütunları için geçerli değildir).
NOT: Bu önceki adım, hava kabarcıklarının SEC sütununun üst kısmında sıkışmasını önler. Hava sıkışırsa, rezervuarı çıkarın, hava kabarcığını çıkarmak için sütuna dokunun ve bağlantı prosedürünü tekrarlayın. Daha küçük sütun için, SEC sütununun üst kısmındaki kapağı açmanız ve numune haznesini takmanız yeterlidir. - Numune deposuna 47 mL (10 mL) PBS ekleyin ve SEC sütununun alt kapağını açın. Denge için yüklenen tüm numune arabelleğinin kolondan akmasına izin verin. Akış akışını atın.
- Numune haznesine en fazla 2 mL (0,5 mL) numune yükleyin, akışı atın ve numunenin kolona tamamen girmesine izin verin.
- PBS'yi derhal numune haznesine veya haznesine numune hacmi eksi 14,25 mL'lik bir hacimde ekleyin (küçük sütun için numune hacmi eksi 3 mL). Çözümün sütundan akmasına izin verin ve sütun boşluk hacmine eşit olan bu miktarı atın.
NOT: Tipik bir 2 mL numune için, numune haznesine veya haznesine eklenecek PBS miktarı 12,25 mL olacaktır. - SEC sütununun hemen altına 2 mL'lik düşük bağlayıcı bir mikrotüp yerleştirin. Hemen numune haznesine 2 mL (0,5 mL) PBS ekleyin ve sütuna girmesine izin verin. Bu ilk 2 mL (0,5 mL) akış geçişini Fraksiyon 1 olarak etiketleyin. Sonraki her fraksiyonu toplamak için numune rezervuarına bir seferde 2 mL (0,5 mL) eklemeye devam edin.
NOT: Çoğu bakteriyel EV, ilk 5 fraksiyonda ortaya çıkar. Optimizasyon sırasında, ilk 12 kesir toplandı. - Kısa süreli depolama için fraksiyonları 4 ° C'de (gün) veya uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın.
- Yeniden kullanılabilir SEC sütunlarının temizlenmesi ve depolanması
NOT: Bu protokolde açıklanan SEC sütunları, üreticiye göre en fazla 5 kez yeniden kullanılabilir. SEC sütunlarının akış hızı <5 kullanımdan sonra azalırsa, üretici, SEC'den önceki agregaları temizlemek için konsantre numunelerin 10.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edilmesini önerir. Ardından, EV izolasyonu için bu santrifüjlemenin süpernatantını SEC sütununa yükleyin.- Her kullanımdan sonra SEC sütununu temizlemek ve saklamak için, 0,5 M NaOH'nin 2 mL'sini (0,5 mL) ekleyin ve sütuna tamamen girmesine izin verin. Kolondan 100 mL (20 mL) %20 etanol geçirin ve bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Bir sonraki kullanımdan önce, etanolün yukarıdaki gibi oda sıcaklığına dengelenmesini sağlayın ve sütundan başka bir 150 mL (30 mL) PBS çalıştırarak PBS tamponu ile değiştirin.
- Her kullanımdan sonra SEC sütununu temizlemek ve hemen yeniden kullanmak için, 0,5 M NaOH'nin 2 mL'sini (0,5 mL) ekleyin ve sütuna tamamen girmesine izin verin. NaOH'yi temizlemek için yaklaşık 150 mL (30 mL) PBS tamponu çalıştırın. Elüatın pH'ı PBS'ye (~7) eşit olduğunda, yeni bir numune yüklenebilir.
- EV'lerin <100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için küçük bir SEC sütunu (10 mL yatak hacmi) ve EV'lerin >100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için daha büyük bir sütun (47 mL yatak hacmi) kullanın.
3. EV hazırlama kalite kontrol
- Sterilite testi
NOT: Bu EV'ler bakteri kültürlerinden geldiğinden, aşağı akış kullanımından önce sterilitenin sağlanması kritik öneme sahiptir.- Tahlillerde kullanılacak fraksiyonların 100 μL'sini (20 μL) elde edin ve kaynak bakterileri büyütmek için kullanılan ortamın 3 mL'sini aşılayın. En az 3 gün boyunca ilgili optimal koşullar altında kültür ve bulanıklık için gözlemleyin. Alternatif olarak, fraksiyon örneklerini, üreten bakterileri büyütmek ve koloni oluşumunu aramak için kullanılan ortamı içeren agar plakalarına uygulayın.
NOT: Bakteriyel kontaminasyon tespit edilirse, deney için EV preparatının kullanılması önerilmez. Bunun yerine, (a) şartlandırılmış bakteriyel hücre kültürü ortamının yeterli santrifüjleme/filtrasyonunu gerçekleştirerek, (b) temiz şişeler, tüpler, filtreler ve kromatografi sütunları kullanarak ve (c) uygun aseptik teknikler kullanarak bakteriyel kontaminasyon riskini en aza indirmeye özen göstererek izolasyonu tekrarlayın.
- Tahlillerde kullanılacak fraksiyonların 100 μL'sini (20 μL) elde edin ve kaynak bakterileri büyütmek için kullanılan ortamın 3 mL'sini aşılayın. En az 3 gün boyunca ilgili optimal koşullar altında kültür ve bulanıklık için gözlemleyin. Alternatif olarak, fraksiyon örneklerini, üreten bakterileri büyütmek ve koloni oluşumunu aramak için kullanılan ortamı içeren agar plakalarına uygulayın.
- Protein niceliği
NOT: Yüksek hassasiyetli, floresan bazlı bir protein niceleme kiti kullanılmıştır ( bkz. Kit, 485/590 nm uyarma/emisyon dalga boylarında eşleşen tescilli bir florimetre ile çalışır.- Tüm reaktifleri, standartları ve numuneleri oda sıcaklığına getirin.
- Her numune ve test edilecek standart için 199 μL tampona 1 μL reaktif ekleyerek bir ana protein reaktifi ve tampon karışımı hazırlayın. İnce duvarlı 0,5 mL PCR tüpleri kullanarak, her standart tüpe 10 μL standart + 190 μL ana karışım ekleyin.
NOT: Tahlil aralığında olmak için, her numune tüpüne eklenecek her fraksiyonun miktarı, saflaştırmanın beklenen protein verimine bağlıdır. Tipik olarak, her fraksiyonun 5 μL'si + 195 μL ana karışım kullanılmıştır. Numune + ana karışımın son hacmi 200 μL olmalıdır. - Tahlil tüplerini vorteks edin ve karanlıkta oda sıcaklığında en az 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Ok düğmelerini kullanarak Protein testi seçeneğini belirleyerek ve onaylamak için GO düğmesine basarak uygun tescilli florimetredeki standartları ölçün (Malzeme Tablosuna bakın). Ekrandaki talimatları izleyin, her standart tüpü takın ve GO tuşuna basın.
- Deneysel numune tüpünü yerleştirin; okumak için GO tuşuna basın; ve tahlil tamponu/numune karışımındaki gerçek protein konsantrasyonu olan görüntülenen sonucu not edin. Numunedeki protein konsantrasyonunu elde etmek için, Numune konsantrasyonunu hesapla seçeneğini belirlemek üzere ok tuşlarını kullanın, GO tuşuna basın ve verilen numune için tahlil tamponuna eklenen numune hacmini seçmek üzere ok tuşlarını kullanın. GO tuşuna basın ve örnek protein konsantrasyonunu kaydedin. Analiz edilecek her örnek için bu adımı yineleyin.
- Partikül sayımı ve boyut dağılımı
NOT: EV konsantrasyonunu ve boyut dağılımını ölçmek için mikroakışkanlar dirençli darbe algılama (MRPS) kullanılmıştır.- PBS'deki numuneleri, 0.02 μm'lik bir şırınga filtresinden yaklaşık 0.1 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonuna filtrelenmiş% 1 Tween-20 ile desteklenmiş olarak seyreltin.
NOT: Seyreltmenin amacı, EV içeren fraksiyonlarda 1010 parçacık/mL aralığında beklenen parçacık konsantrasyonuna ulaşmaktır. Optimal seyreltmenin ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir. Daha sonraki fraksiyonlar için az sayıda EV beklenmektedir (Fraksiyon 6'nın ötesinde). Bu nedenle, partikül konsantrasyonu, düşük seyreltmelerde analiz edilmesine rağmen, muhtemelen <1010 partikül / mL olacaktır. - Her numuneden 3 μL'sini mikropipetle tek kullanımlık mikroakışkanlar kartuşuna yükleyin, kartuşu MRPS cihazına takın ve mavi aydınlatmalı jantlı metal düğmeye basın.
- Edinme yazılımında Go! 'ya tıklayın ve numunenin cihaz tarafından analiz edilmesini bekleyin. Analizin teknik istatistiksel hatasını en aza indirmek için 1.000 ila 10.000 parçacık olayı elde edin. Bu noktada, örnek alımını tamamlamak için Çalıştırmayı Durdur ve Sonlandır'ı tıklatın.
NOT: Ham veri dosyalarıyla birlikte cihaz, numunedeki partikül konsantrasyonunu listeleyen bir özet elektronik tablo çıkarır. Bu değeri, yapılan numune seyreltmesine göre düzeltin. - Analiz yazılımını kullanarak, ham verileri yükleyin ve boyut dağılımının özelleştirilmiş grafiklerini oluşturun.
- PBS'deki numuneleri, 0.02 μm'lik bir şırınga filtresinden yaklaşık 0.1 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonuna filtrelenmiş% 1 Tween-20 ile desteklenmiş olarak seyreltin.
4. EV depolama
- Aliquot bireysel veya havuzlanmış fraksiyonları, düşük protein bağlayıcı tüplerde bireysel fraksiyon boyutunun% 25-50'sine (kullanılan sütunun boyutuna bağlı olarak) ve donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 ° C'de saklayın.
NOT: Farklı uygulamalar, her deneyde kullanılan beklenen miktara bağlı olarak daha küçük veya daha büyük alikotlar gerektirebilir. Bunun ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. EV içermeyen fraksiyonlar, araştırma hedeflerine uygulanamazsa atılabilir.
5. İletim elektron mikroskobu
- Negatif boyama
- Karbon kaplı bakır 400 örgü ızgaraya 5 μL EV numunesi ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Numune tarafını 5 damla 5 mM Tris tamponu (pH 7.1) ve ardından 5 damla damıtılmış su ile yıkayın.
- 5 damla% 2 uranil asetat ile leke örneği tarafı. Filtre kağıdı ile fazladan miktarda lekeyi temizleyin ve ızgaranın birkaç saat veya gece boyunca tamamen kurumasını bekleyin. Örnekleri 80 kV'ta çalışan bir elektron mikroskobu ile görselleştirin.
- İmmünogold etiketleme
- Bir formvar/karbon 400 örgü ızgaraya 10 μL EV süspansiyonu uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Izgarayı PBS'de üç kez yıkayın ve ardından numuneyi sabitlemek için 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit uygulayın. PBS ile ızgaraları beş kez yıkayın.
- Izgarayı,% 0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren üç PBS yıkamasıyla bloke edin. Daha sonra, oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 10 μL birincil antikor uygulayın (burada, 1 μg / mL nluc antikoru). % 0.1 BSA içeren PBS ile üç kez daha yıkayın.
- Izgaraya 10 μL ikincil altın etiketli antikor ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin. Izgaraları PBS ile üç kez yıkayın.
NOT: Burada, 10 nm altın nanopartiküllerle konjuge edilmiş bir keçi anti-fare antikoru, tamponu bloke etmede 1:10 seyreltildikten sonra kullanılmıştır. Altın etiketleme EV görselleştirmesini gizliyorsa, bunun yerine daha küçük altın nanopartiküllere (örneğin 5 nm) sahip ikincil antikorlar kullanılabilir. - Izgarayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 μL% 2.5 glutaraldehit ile sabitleyin. PBS'de üç kez yıkayın. 15 dakika boyunca% 2 uranil asetat (10 μL) ile negatif boyama yapın. Numuneleri 10 dakika boyunca 10 μL% 0.5 uranil asetat ve% 0.13 metil selüloz çözeltisine yerleştirin.
- Elektron mikroskobunda görüntülemeden önce numune ızgaralarının oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin.
- Mikroskop toplama yazılımında, görüntünün optimum kalitesini elde etmek için pozlamayı ampirik olarak belirleyin (örneğin, bu özel kurulumda 0.80851 s) ve bu değeri pozlama süresi seçenek kutusuna yazarak ayarlayın. 80 kV seçeneğini belirleyin ve görüntüyü yakalamak için Almayı Başlat'ı tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EV'ler için hangi SEC kromatografi fraksiyonlarının zenginleştirildiğini değerlendirmek için, SEC kolonuna TFF tarafından 1.000 kat konsantre edilmiş 2 mL E. coli MP1 şartlandırılmış kültür ortamı yüklendi ve sıralı fraksiyonlar toplandı. MRPS kullanılarak, Fraksiyonlar 1-6'nın en fazla EV'yi içerdiği bulunmuştur (Şekil 2A). Sonraki fraksiyonlar, EV-içermeyen proteinler yerine çok az sayıda EV içeriyordu (Şekil 2B). EV'ler öncelikle <100 nm çapındaydı (Şekil 2C). TEM, özellikle 2-6 Fraksiyonlarında EV-zenginleştirme ve boyutunu doğruladı (Şekil 2D).
Yöntemlerin EV'leri EV ile ilişkili olmayan proteinlerden ayırabildiğinden emin olmak için, bir sitolisin A-nanolusiferaz füzyon proteini ve serbest (kaynaşmamış) mCherry'yi ifade eden bir Rekombinant E. coli MP1 suşu üretildi ( Şekil 3A'da şematize edildi). Sitolisin A füzyon proteinlerinin daha önce E. coli EVs14 ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. mCherry floresansını izlemek için, her kromatografi fraksiyonundan 100 μL alikot, 96 kuyucuklu bir plakanın kuyularına aktarıldı. Floresanları, sırasıyla absorpsiyon ve emisyon dalga boyları olarak 580 nm ve 620 nm kullanan bir mikroplaka okuyucuda ölçüldü.
Benzer şekilde, lüminesans ölçümü için, her fraksiyonun 20 μL'lik bir alikotu, 384 kuyucuklu bir plakada eşit hacimli Luciferaz tahlil çözeltisi ile karıştırıldı, 15 dakika boyunca inkübe edildi ve görünür ışık lüminesansı ölçüldü. EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların (Fraksiyonlar 2-7) daha sonraki fraksiyonlarınkiyle karşılaştırılabilir yüksek nanolusiferaz aktivitesine sahip olduğu, ancak EV ile ilişkili olmayan mCherry'den sadece çok düşük bir floresan sinyaline sahip olduğu gözlenmiştir (Şekil 3B). Eşit miktarda negatif kontrol EV'sinden (nanolusiferaz ekspresyonu olmayan eşleşen bir bakteri suşundan izole edilmiş) gelen arka plan sinyali, EV fraksiyonlarında >1.000 kat daha düşüktü. Pozitif kontrolden gelen sinyal (nanolusiferaz eksprese eden bakteriyel hücre peleti), EV fraksiyonlarından (gösterilmemiş) yaklaşık 1.000 kat daha yüksekti. İkincisi, sırasıyla analiz edilen hücreleri veya EV'leri veren hücre kültürü materyalinin ilk hacmine normalleştirildi. Nanolusiferazın EV-ilişkisi, immünogold etiketleme ile Fraksiyonlar 2-5'te doğrulandı (Şekil 3C), izole edilmiş küçük ~ 20 nm EV'ler içindeki etiketlemeyi gözlemledi.
Son olarak, bu protokolün diğer bakteri türlerine uygulanabilirliğini değerlendirmek için, EV'ler aşağıdaki çeşitli anaerobik bakterilerin ~ 100 mL kültürlerinden izole edildi: BHI kültür ortamında hazırlanan A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve ve B. dentium. Bir kontrol olarak, EV'ler taze BHI kültür ortamından izole edildi. EV verimi türlere göre değişirken, erken kromatografi Fraksiyonları 1-4'ün EV'ler için zenginleştirildiği tekrar gözlenmiştir (Şekil 4A). Kompleks BHI ortamı ayrıca, bu preparatlardaki toplam EV veriminin% <25'inde olmasına rağmen, EV boyutunda parçacıklar içeriyordu (Şekil 4A, siyah çubuklar). Bu bakterilerin EV'lerinin de öncelikle <100 nm büyüklüğünde olduğu bulunmuştur (Şekil 4B).
Şekil 2: Erken kromatografi fraksiyonlarında temsili E. coli MP1 EV elüsyonu. (A) Sıralı 2 mL kromatografi fraksiyonlarında MRPS ile partikül sayımı. SEC girişi, 2 mL'ye konsantre edilmiş 2 L bakteri kültürü süpernatanıydı. Düz çizgi ortalamayı temsil eder; gölgeli alan SEM'i gösterir. (B) Her fraksiyondaki protein konsantrasyonu. (C) MRPS ile ölçülen Fraksiyon 3 EV'lerin boyut dağılımı. Düz çizgi ortalamayı temsil eder; gölgeli alan %95 CI'yi temsil eder. Cihazın <50 nm parçacıkları ölçemeyeceğini unutmayın. (D) Sıralı, havuzlanmış kromatografi fraksiyonlarının ve taze kültür ortamının transmisyon elektron mikrografları (kontrol). Tüm görüntüler aynı ölçekte (100 nm) çekilmiştir. Geniş alan TEM görüntüleri Ek Şekil S3'te gösterilmiştir. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; MRPS = mikroakışkanlar dirençli darbe algılama; SEC = boyut dışlama kromatografisi; SEM = ortalamanın standart hatası; CI = güven aralığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: E. coli MP1 EV'lerin EV-içermeyen proteinlerden SEC ile ayrılması. (A) Sitoplazmada rekombinant mCherry (kırmızı) eksprese eden E. coli MP1 şeması ve periplazma kaçakçılığı yapan sitolisin A-nanoLuciferaz füzyon proteini (sarı elmaslar). (B) nanoLuciferaz biyolüminesans aktivitesi ve mCherry floresansı, sıralı olarak salınan kromatografi fraksiyonlarında izlendi. Dikey noktalı çizgi, Şekil 2'deki analizlere dayanarak EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların sınırını temsil eder. (C) EV fraksiyonları (F2-5), anti-nanoLuciferaz antikoru ile boyandıktan sonra immünogold olarak etiketlendi. Camgöbeği ok uçları, küçük EV'lerle birlikte lokalize olan altın konjuge sekonder antikorun işaret eder. Wildtype E. coli MP1'den kontrol EV'leri ihmal edilebilir spesifik olmayan boyamaya sahipti. Her iki görüntü de aynı ölçekte (100 nm) çekilmiştir. Geniş alan TEM görüntüleri Ek Şekil S4'te gösterilmiştir. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; SEC = boyut dışlama kromatografisi; F = fraksiyon; TEM = transmisyon elektron mikroskobu; ClyA-nLuc = sitolisin A-nanoLuciferaz füzyon proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EV'lerin çeşitli bakteri türlerinden izolasyonu. Belirtilen türler anaerobik koşullar altında BHI ortamında 48 saat boyunca kültürlenmiştir. EV'ler, MRPS ile ölçülen ilk 4 SEC fraksiyonunda ultrafiltrasyon + SEC (A) EV konsantrasyonu ile izole edildi. Siyah çubuklar±, bir grup taze BHI ortamında (kontrol) tespit edilen parçacıkları temsil eder. (B) EV'lerin Fraksiyon 2'deki boyut dağılımı. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; MRPS = mikroakışkanlar dirençli darbe algılama; SEC = boyut dışlama kromatografisi; BHI = beyin kalp infüzyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: p114-mCherry-Clyluc plazmid. (A) p114-mCherry-Clyluc plazmidinin haritası. (B) J23114-mCherry-clyA-nluc bölgesinin sırası. Menekşe, J23114 Destekçi; Pembe, mCherry geni; Gri, clyA geni; Yeşil, Bağlayıcı dizisi; Turuncu, nLuc geni. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: Teğetsel akış filtreleme (TFF) kurulum şeması. Dikenli hortumlu boru, gösterildiği gibi TFF cihazına bağlandı. Besleme akış borusu, filtrelenmiş, şartlandırılmış kültür orta kabına batırılmaya başlar, peristaltik pompadan devam eder ve TFF cihazı giriş portuna bağlanır. Geri dönüş akışı, TFF cihaz çıkış portunda başlar ve filtrelenmiş, şartlandırılmış kültür ortamının yüzeyinin üzerinde sona erer. İsteğe bağlı olarak, filtrasyon hızını artırmak için bir karşı basınç kelepçesi (örneğin, bir vida somunu + cıvata veya basit bir kağıt kelepçesi) kullanılabilir. Pompa şartlandırılmış ortamı dolaştırırken, TFF cihazı içinde gelişen basınç, ultrafiltrasyona ve bileşenlerin <100 kDa'nın bertaraf edilmek üzere ayrı bir kapta toplanabilen filtrat / atık akış borusundan çıkarılmasına yol açar (macenta). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: Geniş alan iletim elektron mikrografları. Sıralı, havuzlanmış kromatografi fraksiyonlarının ve taze kültür ortamının (kontrol) TEM görüntüleri Şekil 2D'de gösterilmiştir. Görüntüler, E. coli MP1 hücre dışı veziküllerin erken kromatografi fraksiyonlarında ortaya çıktığını göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S4: Şekil 3C için geniş alan TEM görüntüleri. EV fraksiyonları (F2-5), anti-nano-Luciferaz antikoru ile boyandıktan sonra immünoaltın etiketliydi. Camgöbeği ok uçları, küçük EV'lerle birlikte lokalize olan altın konjuge sekonder antikorun işaret eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Yöntem: P114-mCherryClyluc'u barındıran rekombinant E. coli MP1 suşu için. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki protokolde, ölçeklenebilir ve EV'leri çeşitli gram-negatif / pozitif ve aerobik / anaerobik bakterilerden güvenilir bir şekilde izole eden bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür boyunca birkaç potansiyel durma noktasına sahiptir, ancak EV'leri şartlandırılmış bakteri kültürü ortamından izole etmek için 48 saatten daha uzun sürmekten kaçınmak daha iyidir.
İlk olarak, şartlandırılmış bakteri kültürü ortamı oluşturmak için bakteri kültürlemesinden oluşur. Kültür süresini en az 48 saate çıkarmanın ve optimum büyüme ortamını kullanmanın EV verimini en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olduğu bulunmuştur. Her bakteri türünün bu iki parametreye göre optimize edilmesi gerekecektir. Bakteri kültürünün hacmi, istenen uygulama için yeterli EV'lerin izole edilmesini sağlamak için de önemlidir. İn vitro çalışmalar için, EV'ler tipik olarak en az 100 mL'den izole edilirken, in vivo çalışmalar için EV'ler tipik olarak >1 L kültür ortamından izole edilir. Yine, her bakteri suşunun EV üretim özellikleri ve aşağı akış analizleri için gerekli EV miktarı, minimum başlangıç kültürü hacmini belirleyecektir.
Şartlandırılmış kültür ortamı mevcut olduğunda, hücreler ve büyük EV dışı döküntüler çıkarılmalıdır. Santrifüjlemenin bu süreçte kritik bir adım olduğu tespit edildi. Yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi, iki artan g-kuvveti santrifüjleme gerçekleştirildi. Bazen, ikinci spinin peletinin kompakt olmadığı belirtilirse, ek 10.000 × g santrifüjleme gerçekleştirilir. Daha sonra, bu süpernatantın steril filtrasyonu 0.22 μm'lik bir filtreden gerçekleştirilir. Yetersiz santrifüjleme, tıkanmaya ve bu filtreleme adımının düşük performansına neden olur. Filtrasyon hızı önemli ölçüde yavaşladıktan sonra süpernatantı filtrelemeye devam etmenin, filtre arızasına ve EV preparatının ebeveyn bakterilerle kirlenmesine yol açabileceği belirtildi. Filtrenin sürekli tıkanmasına karşı çözüm, süpernatanın yeniden santrifüj edilmesi ve/veya yeniden filtrelenmesi ve sterilitenin sağlanmasıdır. Açıklanan santrifüjleme ve vakumla çalışan filtreleme adımları, toplam 4 L'ye kadar bakteri kültürü için test edilmiştir. EV izolasyonunun daha da ölçeklendirilmesi modifikasyonlar gerektirebilir. Örneğin, bu adımların her ikisi de, gözenek boyutu 0,22 μm'ye kadar azalan uyumlu filtre cihazları kullanılarak sıralı pompa tahrikli filtreleme ile potansiyel olarak değiştirilebilir. Ancak, bu test edilmeye devam ediyor.
Mevcut protokolde, bakteri kültürünün başlangıç hacmine bağlı olarak iki varyasyon tanımlanmıştır. <100 mL hacimlerde, kültür ortamını konsantre etmek için santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazları kullanın. MWCO bu adımlarda kritik öneme sahiptir. Memeli EV'ler için >300 kDa MWCO daha önce11,12 kullanıldı. Bununla birlikte, bu, muhtemelen daha küçük boyut dağılımı nedeniyle, bakterilerden çok düşük EV verimi ile sonuçlandı. Bu nedenle 100 kDa MWCO kullanılması tavsiye edilir. Daha küçük bir MWCO da kullanılabilir, ancak daha uzun santrifüjleme süreleri ve küçük moleküler ağırlıklı kirleticilerin daha az uzaklaştırılması ile ilişkilidir, bu da numune viskozitesini arttırır. Ayrıca, protokol boyunca farklı başlangıç hacimlerinde numunelerin yoğunlaşmasına yardımcı olmak için 100 kDa MWCO'da çeşitli boyutlarda ultrafiltrasyon cihazlarına sahip olmak da yararlıdır.
Alternatif olarak, önemli ölçüde >100 mL numune boyutları için, numuneyi konsantre etmek için pompa tahrikli TFF kullanın; Yine, 100 kDa MWCO kullanmak çok önemlidir. Bu yöntem, büyük hacimli kültür ortamının yarı otomatik bir şekilde işlenmesini sağlar. Başlangıç kültürü hacmi için uygun boyutta bir TFF cihazı elde etmek önemlidir. Kullanılan cihaz, üretici tarafından 200 mL'ye kadar malzeme işlemede derecelendirilmiştir. Yaklaşık 2 L'ye kadar işlemek mümkündü. Bununla birlikte, daha büyük hacimleri işlemeye çalışırken filtrasyon hızında ciddi bir düşüş gözlendi, bu da işlemin durdurulmasını ve cihazın ek işlemden önce temizlenmesini gerektirdi. Böylece, her bakteri kültürünün özellikleri ve başlangıç malzemesinin miktarı, TFF cihazının gerekli boyutunu belirleyecektir. Ayrıca, ulaşılabilir pompa hızı TFF için bir diğer önemli parametredir. ~ 100 mL / dak'lık düşük oranlarda, filtrenin kirlenme oranını artıran filtrelemeyi kolaylaştırmak için, Ek Şekil S2'de belirtildiği gibi bir kelepçe kullanarak TFF cihazındaki karşı basıncın arttırılması gerekiyordu. Boru, uygun dekontaminasyon ve otoklavlamadan sonra 2 defaya kadar tekrar kullanıldı.
Numune konsantre edildikten sonra, EV'leri izole etmek için bir SEC sütununa yüklenebilir. Küçük EV izolasyonu için optimize edilmiş ticari sütunlar kullanıldı. Küçük başlangıç numuneleri için 0,5 mL yükleme hacmine sahip sütunlar kullanın ve 2 L'ye kadar daha büyük başlangıç numuneleri için 2 mL yükleme hacmine sahip sütunları kullanın. Başlangıç kültürlerinin >2 L'nin işlenmesinin daha büyük sütunlar gerektirmesi muhtemeldir. EV için optimize edilmiş sütun üreticileri şu anda >100 mL konsantre malzeme kabul edebilen SEC sütunları sunmaktadır.
İzole EV'leri karakterize etmek için çeşitli yöntemler kullanılır ve bunların çoğu yaygın olarak bulunur. Normalizasyon, çoğu tahlil için protein konsantrasyonuna dayanıyordu, çünkü bu, diğer niceleme yöntemlerinin (yani, MRPS gibi teknolojilerle parçacık niceleme) çok küçük EV'leri <50 nm tespit edememesinden etkilenmiyordu. MRPS ve diğer nanopartikül niceleme teknolojileri, EV'lerin farklı fraksiyonlar arasındaki göreceli nicelleştirilmesinde yararlı olmaya devam etmektedir.
MRPS nicelemesinin kritik bir yönü, seyreltme seviyesidir. Uygun şekilde seyreltildiğinde, tespit edilen EV'lerin sıklığı çoğu durumda algılama sınırına kadar artmaya devam etmelidir, çünkü cihaz parçacıkları <50 nm ölçemez. Yetersiz seyreltme, yüksek cihaz gürültüsüne yol açacaktır, bu da tepe >65 nm (önerilen C-300 mikroakışkan kartuşunu kullanırken) ile yapay bir çan şeklinde eğri üretecektir. Boyut frekans dağılımı veri analizi sırasında, yeterli seyreltmeye rağmen, 50 nm (cihazın mutlak algılama sınırı) ile 60 nm arasında bir artefakt tepe noktası hala gözlenmektedir. Bu muhtemelen, MRPS tarafından doğru algılama sınırının altında olan ve yine cihaz gürültüsüne yol açan önemli sayıda çok küçük bakteriyel EV'nin (TEM, Şekil 2D'de görselleştirildiği gibi) varlığından kaynaklanmaktadır. Bu durumda, gözlemlenen "zirveden" daha küçük veri noktalarını hariç tutun, bu da verilen numunenin niceliğinin fiili alt sınırı haline gelir.
Bu protokolde açıklandığı gibi, salınımlı kromatografi fraksiyonlarındaki EV bolluğunun, toplam protein konsantrasyonunun ve EV olmayan proteinlerin bolluğunun miktarı, kullanıcıların aşağı akış tahlilleri için hangi fraksiyonların kullanılacağına karar vermelerine yardımcı olabilir. Örneğin, havuzlanmış Fraksiyonlar 7-8'de küçük EV'ler tespit edildi (Şekil 2D); Bununla birlikte, bollukları hemen önceki fraksiyonlardan daha düşükken, toplam protein konsantrasyonu (Şekil 2B) daha yüksekti. Bu, Fraksiyonlar 7-8'in daha yüksek miktarlarda EV ile ilişkili olmayan proteinler içerdiğini ve bu nedenle bazı aşağı akış uygulamaları için istenmeyebileceğini düşündürebilir.
Özetle, ticari olarak temin edilebilen malzemelere dayanan çok yönlü bir EV izolasyon protokolü burada açıklanmaktadır. Bu metodolojinin yaygın olarak kullanılan ultrasantrifüjleme tabanlı yöntemlerle karşılaştırıldığında önemi, farklı kullanıcılar tarafından kolayca çoğaltılabilen ve yüksek oranda ölçeklenebilir olan adımları içermesidir. Bu, in vivo çalışmalar için yeterli materyalin üretilmesini kolaylaştırmak için özellikle önemlidir. EV'leri 100 mL ila 2 L'lik kültürlerden izole etmek için kullanıldı. Mevcut TFF cihazlarının geniş yelpazesi göz önüne alındığında, bu protokolün bazı değişikliklerle daha büyük ölçekli saflaştırmalara uyarlanması mümkündür. Tarif edilen izolasyon protokolü öncelikle EV'lerin fiziksel özelliklerine, yani boyutlarına dayanmaktadır ve muhtemelen bu çalışmada açıklananların ötesindeki bakteri türlerine uygulanabilir.
Açıklanan protokolün bir sınırlaması, temsili sonuçlarda görüldüğü gibi, küçük EV'lerin, özellikle <100 nm'nin izolasyonunu desteklemesidir. Önceki raporlar ayrıca daha büyük bakteriyel EV'lerin varlığını da tanımlamaktadır15,16. Daha büyük bakteriyel EV'lerin izolasyonu, örneğin daha büyük EV'ler için optimize edilmiş SEC sütunlarını kullanarak yukarıdaki protokolün değiştirilmesini gerektirebilir. Bu tür SEC sütunları ticari olarak da temin edilebilir. Dahası, diğer protokoller muhtemelen daha yüksek EV saflığına ulaşabilir (örneğin, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme veya immüno-izolasyon). Ancak, bu yöntemler, bu çalışmada açıklanan yöntemlerin veriminden ve ölçeklenebilirliğinden yoksundur. Bu protokolün gelecekte ek saflaştırma adımlarıyla değiştirilmesi, deneysel ve terapötik uygulamalar için önemli olabilecek preparatların verimini ve saflığını daha da artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yukarıda açıklanan araştırma NIH TL1 TR002549-03 eğitim desteği ile desteklenmiştir. Dr. John C. Tilton ve Zachary Troyer'e (Case Western Reserve University) partikül boyutu analizörü cihazına erişimi kolaylaştırdıkları için teşekkür ederiz; Lew Brown (Spectradyne), partikül boyutu dağılım verilerinin analizinde teknik yardım için; Cornell Üniversitesi'nden Dr. David Putnam, pClyA-GFP plazmid14'ü sağladığı için; ve bize E. coli MP113'ü sağladığı için Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. Mark Goulian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Electron microscope | FEI company | Tecnai G2 SpiritBT | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
- Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
- Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197 (2009).
- Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
- Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
- Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).
- Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
- Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
- Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).
