使用活细胞显微镜测量扩散过程中的细胞边缘突起动力学
Summary
该协议旨在测量扩散细胞边缘突起的动态参数（突起，缩回，褶皱）。
Abstract
多细胞生物的发育和稳态依赖于细胞迁移的协调调节。细胞迁移是组织构建和再生中必不可少的事件，对胚胎发育、免疫反应和伤口愈合至关重要。细胞运动失调会导致病理障碍，如慢性炎症和癌症转移。细胞迁移、组织侵袭、轴突和枝晶生长均以肌动蛋白聚合介导的细胞边缘突起开始。在这里，我们描述了一种简单，高效，省时的方法，用于在扩散过程中对细胞边缘突起动力学进行成像和定量分析。该方法测量细胞边缘膜动力学的离散特征，例如突起，缩回和褶皱，并可用于评估关键肌动蛋白调节剂的操作如何在不同情况下影响细胞边缘突起。
Introduction
细胞迁移是控制所有生物体发育和功能的关键过程。细胞迁移发生在生理条件下，如胚胎发生，伤口愈合和免疫反应，以及病理条件，如癌症转移和自身免疫性疾病。尽管参与不同迁移事件的细胞类型存在差异，但所有细胞运动事件都具有相似的分子机制，这些机制在从原生动物到哺乳动物的进化中是保守的，并且涉及常见的细胞骨架控制机制，这些机制可以感知环境，响应信号并响应调节细胞行为1。
细胞迁移的初始阶段可能是在细胞的前缘形成高度动态的突起。在薄片后面，人们可以找到薄片，它将肌动蛋白与肌球蛋白II介导的收缩力耦合，并介导对底层底物的粘附。薄片由生长因子、细胞因子和细胞粘附受体等细胞外刺激诱导，并由肌动蛋白聚合驱动，肌动蛋白聚合提供推动质膜前进的物理力2，3。许多信号传导和结构蛋白与此有关;其中包括Rho GTPases，它与其他信号协调作用以激活肌动蛋白调节蛋白，例如Arp 2/3复合物，WASP家族蛋白以及Lamellipodia中的Formin和Spire家族的成员2，4，5。
除了肌动蛋白聚合外，肌球蛋白II活性还需要在薄片和前薄片上产生收缩力。这些收缩，也被定义为细胞边缘缩回，也可能是细胞外围树突状肌动蛋白解聚的结果，对于发育薄片前缘和允许突起感知细胞外基质和其他细胞的灵活性并确定迁移方向至关重要6，7，8.不能附着在基质上的细胞边缘突起将形成外周膜褶皱，片状结构，出现在薄片和薄片的腹面上，并相对于迁移方向向后移动。当薄片未能附着在基板上时，在其下方形成后薄片，并机械地将第一个薄片推向上腹面。褶皱中以前与基质平行的肌动蛋白细丝现在变得垂直于它，并且褶皱现在位于前进的薄片上方。向后移动的褶皱落回细胞质基质中，代表了回收薄片肌动蛋白的细胞机制9，10。
在这里，我们描述了一种用于测量细胞边缘突起动力学的测定方法。突起测定使用延时视频显微镜在细胞扩散阶段测量单细胞边缘突起动力学10分钟。通过从这些电影中生成运动记录仪来分析突出动力学。原则上，运动记录仪在时空图中提供移动粒子的详细定量数据，以对细胞边缘动力学进行定性理解。在时间与空间图中为所有图像堆栈绘制移动粒子的强度，其中 X 轴和 Y 轴分别表示时间和距离11。该方法使用带有ImageJ的手动运动记录仪分析来获得详细的定量数据，从而能够在低信噪比和/或高特征密度的情况下从电影和图像中检索信息，并分析在相差光学显微镜下获得的图像或图像质量差。
本文所述的细胞边缘突起动力学测定是一种快速、简单且经济高效的方法。因此，并且由于它已被证明与细胞迁移直接相关11，12，因此在决定执行更多资源要求的方法之前，它可以用作测试细胞运动中涉及的细胞骨架动力学的初步方法。此外，它还能够定量测量细胞骨架蛋白的遗传操作（敲除，敲低或拯救构建体）如何使用简单的平台影响细胞骨架动力学。该测定是探索细胞迁移背景下细胞骨架动力学的指导性模型，可用于阐明细胞运动背后的机制和分子。
Protocol
Representative Results
Discussion
细胞边缘突出动力学，包括突起，缩回和褶皱，既是细胞运动的先决条件，也是潜在的限速事件。在这里，我们描述了一种快速而简单的方法，用于测量扩散过程中细胞边缘突起的动态。该方法可实现短时间成像，生成大量数据，不需要细胞的荧光标记或昂贵的荧光显微镜设备，并且可以用作在决定执行更多资源要求的方法之前测试细胞运动中涉及的细胞骨架动力学的初步方法。此外，可以在该?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH MH115939，NS112121，NS105640和R56MH122449-01A1（给Anthony J. Koleske）和以色列科学基金会（资助编号1462/17和2142/21）（给Hava Gil-Henn）的支持。
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
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