Mesure de la dynamique de la saillie du bord cellulaire pendant la propagation à l’aide de la microscopie à cellules vivantes
Summary
Ce protocole vise à mesurer les paramètres dynamiques (protubérances, rétractions, volants) des protubérances au bord des cellules étalées.
Abstract
Le développement et l’homéostasie des organismes multicellulaires reposent sur une régulation coordonnée de la migration cellulaire. La migration cellulaire est un événement essentiel dans la construction et la régénération des tissus, et est essentielle au développement embryonnaire, aux réponses immunologiques et à la cicatrisation des plaies. La dérégulation de la motilité cellulaire contribue à des troubles pathologiques, tels que l’inflammation chronique et les métastases cancéreuses. La migration cellulaire, l’invasion tissulaire, l’excroissance de l’axone et de la dendrite commencent toutes par des protubérances de bord cellulaire médiées par la polymérisation de l’actine. Nous décrivons ici une méthode simple, efficace et rapide pour l’imagerie et l’analyse quantitative de la dynamique de la saillie des bords cellulaires pendant l’épandage. Cette méthode mesure les caractéristiques discrètes de la dynamique de la membrane du bord cellulaire, telles que les protubérances, les rétractions et les volants, et peut être utilisée pour évaluer l’impact des manipulations des principaux régulateurs d’actine sur les protubérances du bord cellulaire dans divers contextes.
Introduction
La migration cellulaire est un processus critique qui contrôle le développement et la fonction de tous les organismes vivants. La migration cellulaire se produit à la fois dans des conditions physiologiques, telles que l’embryogenèse, la cicatrisation des plaies et la réponse immunitaire, et dans des conditions pathologiques, telles que les métastases cancéreuses et les maladies auto-immunes. Malgré les différences dans les types de cellules qui participent à différents événements migratoires, tous les événements de motilité cellulaire partagent des mécanismes moléculaires similaires, qui ont été conservés dans l’évolution des protozoaires aux mammifères, et impliquent des mécanismes de contrôle cytosquelettiques communs qui peuvent détecter l’environnement, répondre aux signaux et moduler le comportement cellulaire en réponse1.
Une première étape de la migration cellulaire peut être la formation de protubérances très dynamiques au bord d’attaque de la cellule. Derrière le lamellipodium, on peut trouver la lamelle, qui couple l’actine à la contractilité médiée par la myosine II et médie l’adhésion au substrat sous-jacent. Les lamellipodies sont induites par des stimuli extracellulaires tels que les facteurs de croissance, les cytokines et les récepteurs d’adhésion cellulaire et sont entraînées par la polymérisation de l’actine, qui fournit la force physique qui pousse la membrane plasmique vers l’avant2,3. De nombreuses protéines de signalisation et structurelles ont été impliquées dans cela; parmi eux se trouvent les RHO GTPases, qui agissent en coordination avec d’autres signaux pour activer les protéines régulatrices de l’actine telles que le complexe Arp 2/3, les protéines de la famille WASP et les membres des familles Formin et Spire dans les lamellipodies2,4,5.
En plus de la polymérisation de l’actine, l’activité de la myosine II est nécessaire pour générer des forces contractiles au niveau du lamellipodium et de la lamelle antérieure. Ces contractions, également définies comme des rétractions du bord cellulaire, peuvent également résulter de la dépolymérisation de l’actine dendritique à la périphérie de la cellule et sont essentielles pour développer le bord d’attaque lamellipodial et permettre à la saillie de sentir la flexibilité de la matrice extracellulaire et d’autres cellules et de déterminer la direction de la migration6,7,8 . Les protubérances de bord cellulaire qui ne peuvent pas s’attacher au substrat formeront des volants de membrane périphérique, des structures en forme de feuille qui apparaissent sur la surface ventrale de la lamellipodie et de la lamelle et se déplacent vers l’arrière par rapport à la direction de la migration. Comme le lamellipodium ne parvient pas à se fixer au substrat, un lamellipodium postérieur se forme en dessous et pousse mécaniquement le premier lamellipodium vers la surface ventrale supérieure. Les filaments d’actine dans le volant qui étaient autrefois parallèles au substrat deviennent maintenant perpendiculaires à celui-ci, et le volant est maintenant positionné au-dessus du lamellipodium en progression. Le volant qui recule retombe dans le cytosol et représente un mécanisme cellulaire de recyclage de l’actine lamellipodiale9,10.
Ici, nous décrivons un test pour la mesure de la dynamique de la saillie des bords cellulaires. Le test de saillie utilise la microscopie vidéo time-lapse pour mesurer la dynamique de la protrusion d’une seule cellule pendant 10 minutes pendant la phase d’étalement de la cellule. La dynamique de la saillie est analysée en générant des kymographes à partir de ces films. En principe, un kymographe fournit des données quantitatives détaillées sur les particules en mouvement dans un diagramme spatio-temporel pour donner une compréhension qualitative de la dynamique des bords cellulaires. L’intensité de la particule en mouvement est tracée pour toutes les piles d’images dans un diagramme temporel par rapport à l’espace, où l’axe X et l’axe Y représentent respectivement le temps et la distance11. Cette méthode utilise une analyse kymographique manuelle avec ImageJ pour obtenir des données quantitatives détaillées, permettant de récupérer des informations à partir de films et d’images en cas de faible rapport signal/bruit et/ou de densité de caractéristiques élevée, et l’analyse d’images acquises en microscopie optique à contraste de phase ou en mauvaise qualité d’image.
Le test de dynamique de la saillie du bord cellulaire décrit ici est une méthode rapide, simple et rentable. En tant que tel, et parce qu’il a été démontré qu’il est directement corrélé avec la migration cellulaire11,12, il peut être utilisé comme méthode préliminaire pour tester la dynamique du cytosquelette impliquée dans la motilité cellulaire avant de décider d’effectuer des méthodes plus exigeantes en ressources. En outre, il permet également de mesurer quantitativement l’impact des manipulations génétiques (knockout, knockdown ou rescue) des protéines cytosquelettiques sur la dynamique du cytosquelette à l’aide d’une plate-forme simple. Le test est un modèle instructif pour explorer la dynamique du cytosquelette dans le contexte de la migration cellulaire et pourrait être utilisé pour élucider les mécanismes et les molécules sous-jacents à la motilité cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dynamique de la saillie du bord cellulaire, composée de protubérances, de rétractions et de volants, est à la fois une condition préalable et un événement limitant le débit potentiel dans la motilité cellulaire. Nous décrivons ici une méthode rapide et simple pour mesurer la dynamique des protubérances du bord cellulaire pendant l’étalement. Cette méthode permet une imagerie à court terme, génère une quantité importante de données, ne nécessite pas de marquage fluorescent des cellules ou d’équ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions NIH MH115939, NS112121, NS105640 et R56MH122449-01A1 (à Anthony J. Koleske) et de la Fondation israélienne pour la science (subventions numéros 1462/17 et 2142/21) (à Hava Gil-Henn).
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
Riferimenti
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