מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים
Summary
פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.
Abstract
ההתפתחות וההומיאוסטזיס של אורגניזמים רב-תאיים מסתמכים על רגולציה מתואמת של נדידת תאים. נדידת תאים היא אירוע חיוני בבנייה והתחדשות של רקמות, והיא קריטית בהתפתחות העוברית, בתגובות אימונולוגיות ובריפוי פצעים. דיסרגציה של תנועתיות התא תורמת להפרעות פתולוגיות, כגון דלקת כרונית וגרורות סרטן. נדידת תאים, פלישת רקמות, אקסון וצמיחת דנדריט יוזמות כולן עם בליטות של קצה התא בתיווך אקטין פילמור. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה וחוסכת זמן להדמיה וניתוח כמותי של דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מודדת תכונות נפרדות של דינמיקת קרום קצה התא, כגון בליטות, נסיגה וקפלים, וניתן להשתמש בה כדי להעריך כיצד מניפולציות של רגולטורים actin מפתח להשפיע על בליטות קצה התא בהקשרים מגוונים.
Introduction
הגירת תאים היא תהליך קריטי השולט בהתפתחות ובתפקוד של כל האורגניזמים החיים. נדידת תאים מתרחשת הן במצבים פיזיולוגיים, כגון עוברים, ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, והן במצבים פתולוגיים, כגון גרורות סרטן ומחלות אוטואימוניות. למרות ההבדלים בסוגי התאים שלוקחים חלק באירועים נודדים שונים, כל אירועי תנועתיות התאים חולקים מנגנונים מולקולריים דומים, שנשמרו באבולוציה מפרוטוזואה ליונקים, וכוללים מנגנוני בקרה ציטו-שלדיים נפוצים שיכולים לחוש את הסביבה, להגיב לאותותים ולווסת את התנהגות התאים בתגובה1.
שלב ראשוני בנדידת תאים יכול להיות היווצרות של בליטות דינמיות מאוד בקצה המוביל של התא. מאחורי lamellipodium ניתן למצוא את lamella, אשר זוגות פועלים כדי myosin II בתיווך התכווצות ומתווך הידבקות למצע הבסיסי. Lamellipodia מושרה על ידי גירויים חוץ תאיים כגון גורמי גדילה, ציטוקינים, קולטני הידבקות תאים, מונעים על ידי פילמור actin, אשר מספק את הכוח הפיזי שדוחף את קרום הפלזמה קדימה2,3. חלבונים רבים מאותתים ומבניים היו מעורבים בכך; ביניהם הם Rho GTPases, אשר פועלים בתיאום עם אותות אחרים להפעלת חלבונים מווסת actin כגון קומפלקס Arp 2/3, חלבונים משפחתיים WASP, ובני משפחות פורמן וספיר ב lamellipodia2,4,5.
בנוסף פילמור אקטין, פעילות myosin II נדרשת ליצירת כוחות התכווצות ב lamellipodium ואת lamella הקדמי. התכווצויות אלה, המוגדרות גם כנסיגה בקצה התא, יכולות גם לנבוע מדה-פילמוריזציה של אקטין דנדריטי בפריפריה של התא והן קריטיות לפיתוח הקצה המוביל של lamellipodial ולאפשר לבלט לחוש את הגמישות של המטריצה החוץ-תאית ותאים אחרים ולקבוע את כיוון הנדידה6,7,8 . בליטות בקצה התא שאינן יכולות להיצמד למצע ייצרו קפלים של קרום היקפי, מבנים דמויי גיליון המופיעים על פני השטח הגחוניים של lamellipodia ו lamella ולנוע אחורה ביחס לכיוון הנדידה. כאשר הלמליפודיום אינו מתחבר למצע, נוצר מתחתיו למליפודיום אחורי ודוחף באופן מכני את הלאמליפודיום הראשון לכיוון פני השטח הגחוניים העליונים. חוטי האקטין בקפלים שבעבר היו מקבילים למצע הופכים כעת לאנכים לו, והרכישה ממוקמת כעת מעל למליפודיום המתקדם. ההמולה הנעה אחורה חוזרת לציטוסול ומייצגת מנגנון תאי למיחזור אקטין לאמליפודיאלי9,10.
כאן, אנו מתארים בדיקה למדידה של דינמיקת בליטה בקצה התא. בדיקת הבליטה משתמשת במיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן כדי למדוד דינמיקת בליטה בקצה תא בודד במשך 10 דקות במהלך שלב ההתפשטות של התא. דינמיקת בליטה מנותחת על ידי יצירת kymographs מסרטים אלה. באופן עקרוני, קימוגרף מקנה נתונים כמותיים מפורטים של חלקיקים נעים בעלילה מרחבית כדי להניב הבנה איכותית של הדינמיקה של קצה התא. עוצמת החלקיק הנע מותווה עבור כל ערימות התמונה בזמן לעומת תרשים חלל, כאשר ציר ה- X וציר ה- Y מייצגים זמן ומרחק, בהתאמה11. שיטה זו משתמשת בניתוח קימוגרפיה ידני עם ImageJ כדי לקבל נתונים כמותיים מפורטים, המאפשרים אחזור מידע מסרטים ותמונות במקרה של יחס אות לרעש נמוך ו/או צפיפות תכונות גבוהה, וניתוח תמונות שנרכשו במיקרוסקופיית אור ניגודיות פאזה או באיכות תמונה ירודה.
בדיקת הדינמיקה של בליטה בקצה התא המתוארת כאן היא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית. ככזה, ומכיוון שהוא הוכח בקורלציה ישירה עם העברת תאים11,12, זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לבדיקת דינמיקה של שלד cytoskeal מעורב תנועתיות התא לפני שתחליט לבצע שיטות תובעניות יותר משאבים. יתר על כן, הוא גם מאפשר מדידה כמותית של האופן שבו מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט או מבני הצלה) של חלבונים ציטוסקיליים משפיעים על הדינמיקה של השלד באמצעות פלטפורמה פשוטה. הבדיקה היא מודל מאלף לחקר הדינמיקה של השלד הציטוטי בהקשר של נדידת תאים ויכולה לשמש להבהרת המנגנונים והמולקולות שבבסיס תנועתיות התאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
דינמיקת בליטה בקצה התא, המורכבת מהבלטות, נסיגה וקפלים, היא גם תנאי מוקדם וגם אירוע פוטנציאלי להגבלת קצב בתנועתיות התאים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה למדידת הדינמיקה של בליטות בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מאפשרת הדמיה לזמן קצר, מייצרת כמות משמעותית של נתונים, אינה דורשת תיוג פלואור…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH MH115939, NS112121, NS105640, ו R56MH122449-01A1 (לאנתוני ג’יי קולסקה) ומהקרן הישראלית למדע (מענקים מספר 1462/17 ו-2142/21) (לחוה גיל-חן).
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
Riferimenti
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. . The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers–assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochimica. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
