Detta protokoll syftar till att mäta de dynamiska parametrarna (utsprång, indragningar, volanger) av utsprång vid kanten av spridande celler.
Utvecklingen och homeostasen av multicellulära organismer är beroende av samordnad reglering av cellmigration. Cellmigration är en viktig händelse vid konstruktion och regenerering av vävnader och är avgörande för embryonal utveckling, immunologiska svar och sårläkning. Dysregulering av cellmotilitet bidrar till patologiska störningar, såsom kronisk inflammation och cancermetastasering. Cellmigration, vävnadsinvasion, axon och dendritutväxt initieras alla med aktinpolymerisationsmedierade cellkantsutsprång. Här beskriver vi en enkel, effektiv och tidsbesparande metod för avbildning och kvantitativ analys av cellkantsutsprångsdynamik under spridning. Denna metod mäter diskreta egenskaper hos cellkantsmembrandynamiken, såsom utsprång, indragningar och volanger, och kan användas för att bedöma hur manipuleringar av viktiga aktinregulatorer påverkar cellkantsutsprång i olika sammanhang.
Cellmigration är en kritisk process som styr utvecklingen och funktionen hos alla levande organismer. Cellmigration sker i både fysiologiska tillstånd, såsom embryogenes, sårläkning och immunsvar, och i patologiska tillstånd, såsom cancermetastaser och autoimmun sjukdom. Trots skillnader i celltyper som deltar i olika migrationshändelser delar alla cellmotilitetshändelser liknande molekylära mekanismer, som har bevarats i evolutionen från protozoer till däggdjur, och involverar gemensamma cytoskelettkontrollmekanismer som kan känna av miljön, svara på signaler och modulera cellbeteende som svar1.
Ett första steg i cellmigration kan vara bildandet av mycket dynamiska utsprång vid cellens framkant. Bakom lamellipodiet kan man hitta lamellen, som kopplar aktin till myosin II-medierade kontraktilitet och förmedlar vidhäftning till det underliggande substratet. Lamellipodi induceras av extracellulära stimuli såsom tillväxtfaktorer, cytokiner och celladhesionsreceptorer och drivs av aktinpolymerisation, vilket ger den fysiska kraften som skjuter plasmamembranet framåt2,3. Många signalerings- och strukturproteiner har varit inblandade i detta; bland dem är Rho GTPaser, som verkar samordnat med andra signaler för att aktivera aktinreglerande proteiner såsom Arp 2/3-komplexet, WASP-familjeproteiner och medlemmar av Formin- och Spire-familjerna i lamellipodia2,4,5.
Förutom aktinpolymerisation krävs myosin II-aktivitet för att generera kontraktila krafter vid lamellipodiet och den främre lamellen. Dessa sammandragningar, även definierade som cellkantsindragningar, kan också bero på depolymerisation av dendritiskt aktin vid cellperiferin och är kritiska för att utveckla den lamellipodiella framkanten och låta utsprånget känna av flexibiliteten hos den extracellulära matrisen och andra celler och bestämma migrationsriktningen6,7,8 . Cellkantsutsprång som inte kan fästa vid substratet kommer att bilda perifera membranvolanger, arkliknande strukturer som uppträder på den ventrala ytan av lamellipodi och lamell och rör sig bakåt i förhållande till migrationsriktningen. Eftersom lamellipodiet inte fäster vid substratet bildas ett bakre lamellipodium under det och skjuter mekaniskt det första lamellipodiet mot den övre ventrala ytan. Aktinfilamenten i volangen som tidigare var parallella med substratet blir nu vinkelräta mot det, och volangen är nu placerad ovanför det framåtskridande lamellipodiet. Ruffle som rör sig bakåt faller tillbaka i cytosolen och representerar en cellulär mekanism för återvinning av lamellipodial aktin9,10.
Här beskriver vi en analys för mätning av cellkantsutsprångsdynamik. Utskjutningsanalysen använder time-lapse-videomikroskopi för att mäta utskjutningsdynamiken med en enda cellkant i 10 minuter under cellens spridningsfas. Utskjutningsdynamiken analyseras genom att generera kymografer från dessa filmer. I princip ger en kymograf detaljerade kvantitativa data om rörliga partiklar i ett spatiotemporalt diagram för att ge en kvalitativ förståelse av cellkantdynamiken. Intensiteten hos den rörliga partikeln ritas för alla bildstaplar i ett tids- kontra rymddiagram, där X-axeln respektive Y-axeln representerar tid och avstånd11. Denna metod använder en manuell kymografanalys med ImageJ för att få detaljerade kvantitativa data, vilket gör det möjligt att hämta information från filmer och bilder vid lågt signal-brusförhållande och / eller hög funktionsdensitet och analys av bilder som förvärvats i faskontrastljusmikroskopi eller dålig bildkvalitet.
Cellkantsutskjutningsdynamikanalysen som beskrivs här är en snabb, enkel och kostnadseffektiv metod. Som sådan, och eftersom det har visat sig direkt korrelera med cellmigration11,12, kan det användas som en preliminär metod för att testa cytoskelettdynamik som är involverad i cellmotilitet innan man bestämmer sig för att utföra mer resurskrävande metoder. Dessutom möjliggör det också kvantitativ mätning av hur genetiska manipulationer (knockout, knockdown eller räddningskonstruktioner) av cytoskelettproteiner påverkar cytoskelettdynamiken med hjälp av en enkel plattform. Analysen är en lärorik modell för att utforska cytoskelettdynamik i samband med cellmigration och kan användas för att belysa de mekanismer och molekyler som ligger bakom cellmotilitet.
Cellkantsutsprångsdynamik, bestående av utsprång, indragningar och volanger, är både en förutsättning och en potentiell hastighetsbegränsande händelse i cellmotilitet. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att mäta dynamiken i cellkantsutsprång under spridning. Denna metod möjliggör kortvarig avbildning, genererar en betydande mängd data, kräver inte fluorescerande märkning av celler eller dyr fluorescerande mikroskopiutrustning och kan användas som en preliminär metod för att testa cytoskele…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag NIH MH115939, NS112121, NS105640 och R56MH122449-01A1 (till Anthony J. Koleske) och från Israel Science Foundation (bidragsnummer 1462/17 och 2142/21) (till Hava Gil-Henn).
10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |