Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas
Summary
Este protocolo tiene como objetivo medir los parámetros dinámicos (protuberancias, retracciones, volantes) de las protuberancias en el borde de las células que se propagan.
Abstract
El desarrollo y la homeostasis de los organismos multicelulares se basan en la regulación coordinada de la migración celular. La migración celular es un evento esencial en la construcción y regeneración de tejidos, y es fundamental en el desarrollo embrionario, las respuestas inmunológicas y la cicatrización de heridas. La desregulación de la motilidad celular contribuye a los trastornos patológicos, como la inflamación crónica y la metástasis del cáncer. La migración celular, la invasión tisular, el axón y el crecimiento de la dendrita se inician con protuberancias de borde celular mediadas por polimerización de actina. Aquí, describimos un método simple, eficiente y que ahorra tiempo para la obtención de imágenes y el análisis cuantitativo de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación. Este método mide las características discretas de la dinámica de la membrana del borde celular, como protuberancias, retracciones y volantes, y se puede utilizar para evaluar cómo las manipulaciones de los reguladores clave de actina afectan las protuberancias del borde celular en diversos contextos.
Introduction
La migración celular es un proceso crítico que controla el desarrollo y la función de todos los organismos vivos. La migración celular ocurre tanto en condiciones fisiológicas, como la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la respuesta inmune, como en condiciones patológicas, como metástasis de cáncer y enfermedades autoinmunes. A pesar de las diferencias en los tipos de células que participan en diferentes eventos migratorios, todos los eventos de motilidad celular comparten mecanismos moleculares similares, que se han conservado en la evolución de los protozoos a los mamíferos, e involucran mecanismos comunes de control citoesquelético que pueden detectar el entorno, responder a las señales y modular el comportamiento celular en la respuesta1.
Una etapa inicial en la migración celular puede ser la formación de protuberancias altamente dinámicas en el borde delantero de la célula. Detrás del lamellipodium se puede encontrar la lámina, que acopla la actina a la contractilidad mediada por la miosina II y media la adhesión al sustrato subyacente. Los lamellipodia son inducidos por estímulos extracelulares como factores de crecimiento, citoquinas y receptores de adhesión celular y son impulsados por la polimerización de actina, que proporciona la fuerza física que empuja la membrana plasmática hacia adelante2,3. Muchas proteínas estructurales y de señalización han sido implicadas en esto; entre ellas se encuentran las Rho GTPasas, que actúan coordinadamente con otras señales para activar proteínas reguladoras de actina como el complejo Arp 2/3, las proteínas de la familia WASP y miembros de las familias Formin y Spire en lamellipodia2,4,5.
Además de la polimerización de actina, se requiere actividad de miosina II para generar fuerzas contráctiles en el lamelepodeio y la lámina anterior. Estas contracciones, también definidas como retracciones del borde celular, también pueden resultar de la despolimerización de la actina dendrítica en la periferia celular y son críticas para desarrollar el borde de ataque lamellipodial y permitir que la protuberancia detecte la flexibilidad de la matriz extracelular y otras células y determine la dirección de la migración6,7,8 . Las protuberancias del borde celular que no pueden unirse al sustrato formarán volantes de membrana periférica, estructuras en forma de lámina que aparecen en la superficie ventral de los lamellipodia y las láminas y se mueven hacia atrás en relación con la dirección de la migración. A medida que el lamellipodium no se adhiere al sustrato, se forma un lamellipodium posterior debajo de él y empuja mecánicamente el primer lamellipodium hacia la superficie ventral superior. Los filamentos de actina en el volante que antes eran paralelos al sustrato ahora se vuelven perpendiculares a él, y el volante ahora se coloca sobre el lamellipodium que avanza. El volante que se mueve hacia atrás cae de nuevo en el citosol y representa un mecanismo celular para reciclar la actina lamellipodial9,10.
Aquí, describimos un ensayo para la medición de la dinámica de protrusión del borde celular. El ensayo de protrusión utiliza microscopía de video de lapso de tiempo para medir la dinámica de protrusión de borde celular único durante 10 minutos durante la fase de propagación de la célula. La dinámica de protrusión se analiza generando kymographs a partir de estas películas. En principio, un kymograph imparte datos cuantitativos detallados de partículas en movimiento en una gráfica espaciotemporal para obtener una comprensión cualitativa de la dinámica del borde celular. La intensidad de la partícula en movimiento se traza para todas las pilas de imágenes en una gráfica de tiempo versus espacio, donde el eje X y el eje Y representan el tiempo y la distancia, respectivamente11. Este método utiliza un análisis manual de kymograph con ImageJ para obtener datos cuantitativos detallados, lo que permite recuperar información de películas e imágenes en caso de baja relación señal-ruido y / o alta densidad de características, y el análisis de imágenes adquiridas en microscopía de luz de contraste de fase o mala calidad de imagen.
El ensayo de dinámica de protrusión de borde celular descrito aquí es un método rápido, simple y rentable. Como tal, y debido a que se ha demostrado que se correlaciona directamente con la migración celular11,12, se puede utilizar como un método preliminar para probar la dinámica citoesquelética involucrada en la motilidad celular antes de decidir realizar métodos más exigentes en recursos. Además, también permite la medición cuantitativa de cómo las manipulaciones genéticas (knockout, knockdown o construcciones de rescate) de proteínas citoesqueléticas afectan la dinámica citoesquelética utilizando una plataforma sencilla. El ensayo es un modelo instructivo para explorar la dinámica citoesquelética en el contexto de la migración celular y podría usarse para dilucidar los mecanismos y moléculas subyacentes a la motilidad celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dinámica de protrusión del borde celular, compuesta de protuberancias, retracciones y volantes, es tanto un requisito previo como un evento potencial limitante de la velocidad en la motilidad celular. Aquí describimos un método rápido y simple para medir la dinámica de las protuberancias del borde celular durante la propagación. Este método permite obtener imágenes a corto plazo, genera una cantidad significativa de datos, no requiere el etiquetado fluorescente de las células o el costoso equipo de microscop…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH MH115939, NS112121, NS105640 y R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) y de la Fundación de Ciencias de Israel (subvenciones número 1462/17 y 2142/21) (a Hava Gil-Henn).
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
Riferimenti
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