Summary
Una piattaforma potenziata per la coltura di embrioni interi consente uno sviluppo continuo e robusto in ex utero di embrioni di topo post-impianto per un massimo di sei giorni, dalle fasi di pre-costruzione fino all'organogenesi avanzata. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura standard per la coltura embrionale di successo utilizzando piastre statiche e sistemi di bottiglie rotanti.
Abstract
I metodi di coltura embrionale dei mammiferi post-impianto sono stati generalmente inefficienti e limitati a brevi periodi dopo la dissezione dall'utero. Recentemente sono state sviluppate piattaforme per colture ex utero altamente robuste e prolungate di embrioni di topo da stadi uovo-cilindro fino all'organogenesi avanzata. Queste piattaforme consentono uno sviluppo appropriato e fedele degli embrioni pregastrulanti (E5.5) fino allo stadio di formazione degli arti posteriori (E11). Gli embrioni a gastrulazione tardiva (E7.5) vengono coltivati in bottiglie rotanti in questi ambienti, mentre la coltura estesa dalle fasi di pre-costruzione (E5.5 o E6.5) richiede una combinazione di colture di bottiglie statiche e rotanti. Inoltre, la regolazione sensibile della concentrazione di O2 e CO2 , la pressione del gas, i livelli di glucosio e l'uso di uno specifico terreno di coltura ex utero sono fondamentali per il corretto sviluppo dell'embrione. Qui viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la coltura estesa di embrioni di topo ex utero. La capacità di far crescere embrioni di topo normali ex utero dalla gastrulazione all'organogenesi rappresenta uno strumento prezioso per caratterizzare l'effetto di diverse perturbazioni sperimentali durante lo sviluppo embrionale.
Introduction
Lo sviluppo intrauterino dell'embrione di mammifero ha limitato lo studio delle prime fasi dello sviluppo post-impianto1,2. L'inaccessibilità dell'embrione in via di sviluppo ostacola la comprensione dei principali processi di sviluppo che si verificano dopo l'impianto dell'embrione nell'utero, come la definizione del piano del corpo animale, la specifica degli strati germinali o la formazione di tessuti e organi. Inoltre, le dimensioni molto ridotte dell'embrione postimpinato precoce rendono difficile l'osservazione mediante imaging intravitale in utero prima di E103. L'incapacità di osservare e manipolare gli embrioni viventi in queste fasi ha limitato lo studio dell'embriogenesi post-impianto precoce a istantanee durante lo sviluppo.
I protocolli per la coltura in vitro di embrioni di mammiferi preimpianto sono ben consolidati, affidabili e utilizzati regolarmente4. Tuttavia, i tentativi di stabilire sistemi di coltura ex utero in grado di supportare una corretta crescita embrionale post-impianto di mammiferi hanno avuto un successo limitato5. Una varietà di tecniche di coltura sono state proposte per oltre un secolo, principalmente coltivando gli embrioni in piastre statiche convenzionali6,7,8 o bottiglie rotanti (colture a rulli)5,9,10. Queste piattaforme si sono rivelate utili per ampliare le conoscenze sullo sviluppo dei mammiferi dopo l'impianto11,12, nonostante siano altamente inefficienti per la normale sopravvivenza degli embrioni e limitate a brevi periodi. Gli embrioni hanno iniziato a mostrare ritardo dello sviluppo e anomalie morfologiche già 24-48 ore dopo l'inizio della coltura.
Questo studio fornisce una descrizione dettagliata per la creazione del sistema di coltura embrionale ex utero che consente uno sviluppo continuo dalla fase pre-costruzione alle fasi avanzate di organogenesi fino a sei giorni di sviluppo post-impianto13. Questo documento descrive il protocollo di coltura a rulli migliorato che supporta la crescita degli embrioni E7.5 (piastra neurale e stadio headfold) fino allo stadio di formazione degli arti posteriori (~ E11) e la coltura estesa da E5.5 / E6.5 combinando la coltura su piastre statiche e piattaforme di coltura a rulli.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la protezione degli animali del Weizmann Institute of Science e approvati dal weizmann Institute IACUC (# 01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Alle donne incinte sane è stato chiesto di dare il loro consenso informato per raccogliere sangue dal loro cordone ombelicale, come approvato dal Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Agli adulti sani è stato chiesto il loro consenso informato per raccogliere il sangue secondo le linee guida del Comitato di Helsinki del Weizmann Institute of Science (# 1566-3).
1. Preparazione dei media
- Preparare il mezzo di dissezione utilizzando 500 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco senza rosso fenolo e L-glutammina, integrato con siero bovino fetale al 10%, 5 ml di penicillina / streptomicina e sterilizzare con filtro con un filtro da 0,22 μm.
NOTA: Mantenere il mezzo di dissezione a 4 °C per un massimo di 1 mese. - Preparare il terreno di coltura embrionale ex utero (EUCM) ogni giorno di coltura all'interno di un cappuccio biologico utilizzando il 25% del mezzo embrionale più il 50% di siero di ratto e il 25% di siero del sangue del cordone ombelicale umano (HCS) o siero di sangue umano adulto (HBS).
- Per preparare il mezzo embrionale, aggiungere 5 ml di glutammina, 5 ml di HEPES e 5 ml di penicillina / streptomicina in 500 ml di DMEM senza rosso fenolo e L-glutammina. Preparare aliquote da 10-15 ml e conservarle a 4 °C per un massimo di due mesi.
NOTA: Raddoppiare la concentrazione di antibiotici in caso di contaminazione. - Inattivare termicamente il siero di ratto a 56 °C per 30-45 minuti e filtrare attraverso un filtro al polivinilidene difluoruro da 0,22 μm. Usa il siero per la cultura lo stesso giorno dell'inattivazione. Scongelare HCS o HBS e usarlo immediatamente per esperimenti.
NOTA: Il siero di ratto commerciale fornisce risultati coerenti (un minimo di 4 lotti sono stati testati senza evidenti variazioni). In alternativa, il siero di ratto di alta qualità può essere ottenuto internamente come descritto in precedenza8,14. Se HCS non è disponibile, sostituirlo con HBS raccolto internamente. Il siero di ratto, HCS e HBS possono essere ricongelati una volta e mantenuti a -20 °C per l'uso in un giorno diverso. Scongelare e combinare il siero ricongelato con un volume maggiore di siero appena scongelato e non ricongelarlo.
2. Raccolta del siero del sangue del cordone ombelicale umano e del siero del sangue umano adulto
- Per isolare l'HCS, raccogliere il sangue del cordone ombelicale da donne in gravidanza sane il giorno del parto cesareo programmato.
- Doppio morsetto del cordone ombelicale a 5-7 cm dall'ombelico e transetto tra i morsetti immediatamente dopo il parto del bambino.
- Prelevare manualmente il sangue utilizzando un ago da 14 G di grandi dimensioni e una siringa da 50 ml direttamente dalla vena ombelicale mentre la placenta rimane in situ per evitare qualsiasi traccia di emolisi.
NOTA: Raccogliere il sangue dopo che il bambino è stato rimosso dal campo della chirurgia, e il sangue ombelicale è stato prelevato per i test clinici.
- Erogare il sangue raccolto in provette sterili procoagulanti da 5 mL e trasferirle immediatamente a 4 °C per 15 minuti per consentire la completa coagulazione. Centrifugare le provette coagulate a 2.500 × g per 10 minuti a 4 °C.
- Scartare i tubi che mostrano segni di emolisi (siero rosa-rosso). Raccogliere il siero (di colore giallo) utilizzando una pipetta da 5 ml e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm. Inattivare il siero immediatamente a bagnomaria a 56 °C per 45 minuti.
- Preparare aliquote da 1-1,5 ml del siero inattivato e conservarle a -80 °C per un massimo di sei mesi. Se necessario, spedire a -70 °C utilizzando ghiaccio secco.
- Per la raccolta di siero di sangue umano adulto, prelevare il sangue da adulti sani e isolare immediatamente il siero seguendo lo stesso protocollo descritto per il siero del sangue del cordone ombelicale. Conservare l'HBS come aliquote inattivate dal calore e filtrate a -80 °C per un massimo di sei mesi.
NOTA: Il siero del cordone ombelicale umano umano e il siero umano adulto preparato appena in-house hanno dato risultati superiori al siero disponibile in commercio. Raccogliere HCS da donne sane, di età superiore ai 18 anni e sotto i 40 anni previste per il parto cesareo. Escludere le donne che hanno partorito vaginalmente e le donne con qualsiasi malattia cronica o condizioni mediche attive, tra cui diabete gestazionale o ipertensione.
3. Coltura ex utero di embrioni da E7,5 a E11
- Impostazione dell'incubatore di colture a rulli e del regolatore di gas
- Coltura E7.5 o più embrioni avanzati utilizzando il sistema di incubatore di colture a rulli. Accendere il rotatore e l'unità di riscaldamento a 37 °C per almeno 1 ora prima delle dissezioni embrionali. Aggiungere acqua autoclavata alla bombola di ingresso del gas e alla provetta di uscita.
NOTA: Posizionare un termometro adiacente al tamburo rotante e controllare frequentemente la stabilità della temperatura all'interno dell'incubatore. Aprire l'incubatrice il più rapidamente possibile poiché il tempo di apertura prolungato aumenterà la temperatura e influenzerà lo sviluppo dell'embrione. Se necessario, aggiungere più acqua autoclavata alla bombola di ingresso del gas e alla provetta di uscita per mantenerli ad una capacità minima di metà durante la coltura. Proteggere gli embrioni all'interno dell'incubatrice dalla luce coprendo l'incubatrice con un panno. - Accendere il modulo regolatore del gas premendo l'interruttore principale e successivamente accendendo i regolatori di ossigeno/azoto e CO2 (Figura 1A). Impostare i valori di ossigeno e CO2 al 5% utilizzando i rispettivi controller. Aprire il regolatore del gas e impostare la pressione del gas su ~ 6,5-7 libbre per pollice quadrato (psi) spostando l'interruttore di tensione nel trasmettitore di pressione (Figura 1B). Confermare il valore della pressione del gas utilizzando un manometro digitale.
- Monitorare il flusso di gas controllando la velocità delle bolle create all'interno della provetta riempita d'acqua in uscita allocata all'interno dell'incubatore di precisione. Impostare la corretta velocità di bolla chiudendo / aprendo la valvola di flusso del gas sul coperchio della bottiglia d'acqua. Assicurarsi che il flusso di gas consenta la formazione di bolle ad una velocità di 2-4 bolle al secondo o impostare il flusso di bolle nel primo punto in cui il gorgogliamento esce dal tubo di uscita pieno d'acqua.
- Riempire le bottiglie di coltura con 2 ml di terreno di coltura e inserirle nel tamburo rotante scavato per la preequilibrazione per 1 ora. Usa i bungs di silicio scavati per sigillare le bottiglie al tamburo. Tenere sigillati gli spazi vuoti nel tamburo rotante usando i bungs solidi.
NOTA: L'assenza di bolle nel tubo di uscita (nessun gas che passa attraverso il sistema) o un flusso di gas eccezionalmente elevato possono influenzare lo sviluppo dell'embrione. In caso di mancanza di flusso di bolle alla provetta di uscita, controllare che tutti i bung di silicio siano posizionati correttamente nel tamburo rotante e sigillare il sistema, e controllare che la bottiglia d'acqua sia chiusa correttamente e che tutti i tubi siano collegati correttamente. Una mancanza di gorgogliamento che entra nella bottiglia d'acqua può indicare un malfunzionamento nel regolatore del gas.
- Coltura E7.5 o più embrioni avanzati utilizzando il sistema di incubatore di colture a rulli. Accendere il rotatore e l'unità di riscaldamento a 37 °C per almeno 1 ora prima delle dissezioni embrionali. Aggiungere acqua autoclavata alla bombola di ingresso del gas e alla provetta di uscita.
- Dissezione di embrioni di topo da topi gravidi
- Preequilibratare il mezzo di dissezione all'interno di un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per un minimo di 1 ora. Lasciare il coperchio leggermente aperto per consentire lo scambio di gas.
- Sacrificare la femmina incinta per lussazione cervicale, pulire l'addome della femmina con il 70% di etanolo e tagliare la pelle e la parete addominale con le forbici. Individuare un'estremità dell'utero e tagliare all'intersezione tra l'ovaio e l'utero. Quindi, tagliare lungo l'utero fino all'altra estremità e trasferirlo in una capsula di Petri da 100 mm riempita con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco a temperatura ambiente (DPBS).
NOTA: Si raccomanda l'uso di femmine non innescate da ormoni, accoppiate naturalmente. - Lavare rapidamente i conceptuses in DPBS e tagliarli a coppie per facilitare la gestione degli embrioni. Sposta tutte le coppie di conceptuse in un mezzo di dissezione preequilibrato in una capsula di Petri da 60 mm e tagliale in singoli conceptuses.
- Rimuovere la parete uterina dei conceptuses strappando il tessuto uterino usando un paio di pinze grossolane. Utilizzare una pinza microchirurgica fine per tagliare la punta della decidua a forma di pera. Inserire la pinza accanto all'embrione parallelamente al suo asse lungo e aprire la pinza per dividere la decidua a metà.
- Infine, lasciare intatto il cono ectoplacentare attaccato al cilindro dell'uovo afferrando l'embrione dalla decidua e staccando il sacco vitellino parietale dall'embrione usando una pinza fine.
NOTA: Per evitare di influenzare l'embrione, eseguire dissezioni su un microscopio dotato di piastra riscaldante a 37 °C entro un massimo di 30-40 min. Seziona una cucciolata di embrioni alla volta. - Subito dopo la dissezione, trasferire gli embrioni su una nuova piastra riempita con un mezzo di dissezione equilibrato utilizzando una pipetta Pasteur di vetro per evitare che gli embrioni si attacchino ai detriti tissutali.
- Selezionare quegli embrioni nella piastra neurale / fase iniziale di piegatura della testa che non mostrano danni nell'epiblasto e trasferire 5-6 embrioni per bottiglia alle bottiglie di coltura di vetro preequilibrate.
NOTA: Per preparare la pipetta Pasteur in vetro, tagliare l'apertura della pipetta a una dimensione adeguata per adattarsi agli embrioni usando un tagliavetro e tenerla in etanolo per evitare contaminazioni. Lavare la pipetta di vetro con PBS prima di trasferire gli embrioni. Quando si trasferiscono gli embrioni nella bottiglia di coltura, assicurarsi di trasportare il minor volume possibile del mezzo di dissezione per evitare di diluire l'EUCM. - Posizionare le bottiglie nel sistema di coltura rotante a 37 °C, in un'atmosfera del 5% di O2 e del 5% di CO2.
- Ogni giorno di coltura, rimuovere i flaconi uno per uno dall'incubatrice per valutare lo sviluppo embrionale sotto uno stereomicroscopio. Assicurati di chiudere il foro vuoto nel tamburo con un bung solido quando rimuovi una bottiglia. Tagliare la punta di una pipetta Pasteur di plastica sterile per adattarla alle dimensioni dell'embrione e spostare gli embrioni in una capsula di Petri per facilitare l'osservazione. Assicurati che gli embrioni siano sempre coperti da un mezzo.
NOTA: Ridurre al minimo il tempo per il quale gli embrioni sono al di fuori dell'incubatrice per evitare effetti dannosi negli embrioni a causa di una diminuzione della temperatura corporea. Maneggiare attentamente gli embrioni per evitare la rottura dei vasi sanguigni del sacco vitellino, influenzando la sopravvivenza dell'embrione. - Al giorno di coltura 1 (equivalente a E8.5), trasferire gruppi di 3 embrioni in un nuovo flacone con 2 ml di EUCM fresco e preequilibrato contenente 3 mg/mL extra di D-glucosio e una miscela di gas del 13% di O2, 5% di CO2.
- Dopo 48 ore (equivalenti a E9,5), trasferire gruppi di due embrioni in un nuovo flacone con EUCM preriscaldato fresco più 3,5 mg/mL di glucosio in un'atmosfera gassosa del 18% di O2 e del 5% di CO2.
- A 72 ore di coltura (equivalenti a E10,5), spostare ogni embrione in un singolo flacone contenente 1,5-2 ml di terreno fresco integrato con 4 mg/mL di glucosio e un apporto di gas del 21% di O2 e del 5% di CO2.
NOTA: Gli embrioni raggiungono la loro massima crescita verso la mezzanotte del giorno di coltura 4. - Utilizzare una pinza fine per rimuovere il sacco vitellino e l'amnione e staccare il cordone ombelicale per una corretta osservazione della morfologia dell'embrione. Spegnere il modulo di regolazione del gas e l'incubatore di precisione.
NOTA: Preequilibrare il terreno di coltura per 1 ora mediante incubazione all'interno di una bottiglia di vetro nella coltura a rulli con un'atmosfera di gas adeguata in base allo stadio embrionale. Pulire le bottiglie di coltura e tutti gli oggetti in vetro dell'incubatore dopo ogni utilizzo eseguendo tre lavaggi con acqua distillata corrente seguita da un lavaggio notturno immerso nel 70% di etanolo. Lavare tre volte con acqua distillata corrente, lasciare asciugare le bottiglie durante la notte e sterilizzare in autoclave. Allo stesso modo, autoclave i tappi di silicio regolarmente. Pulire accuratamente tutti gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% e sterilizzarli a secco.
4. Coltura embrionale estesa da E5.5/E6.5 a E11
- Embrioni di coltura pre-strulazione (E5.5) e gastrulazione precoce (E6.5) fino allo stadio di somite precoce (E8.5) in piastre statiche.
- Preequilibrare il mezzo di dissezione per 1 ora in un incubatore con il 5% di CO2 a 37 °C.
NOTA: Per consentire lo scambio di gas, non chiudere completamente il coperchio del tubo. - Preparare le piastre di coltura aggiungendo 250 μL di EUCM appena preparato a ciascun pozzetto. Posizionare le piastre all'interno di un incubatore a CO2 a 37 °C per la preequilibrazione.
NOTA: Sebbene le piastre a 8 pozzetti siano adatte per la crescita dell'embrione, la coltura può essere eseguita in qualsiasi altra piastra regolando il volume del mezzo in base alle dimensioni della piastra. - Sezionare gli embrioni cilindrici dell'uovo fuori dall'utero seguendo la tecnica descritta per E7.5. Rimuovere il sacco vitellino parietale dell'embrione e lasciare intatto il cono ectoplacentare attaccato al cilindro dell'uovo.
- Trasferire i singoli embrioni in ciascun pozzetto della piastra a 8 pozzetti utilizzando una micropipetta e posizionare la piastra all'interno dell'incubatrice con il 5% di CO2 a 37 °C.
- Immaginate gli embrioni sotto uno stereomicroscopio e selezionate per la coltura solo quelli con una cavità amniotica ben formata, senza danni evidenti e senza la membrana di Reichert.
NOTA: utilizzare punte di pipetta da 20 μL per trasferire embrioni E5.5 e punte da 200 μL per trasferire embrioni E6.5. Nel caso di colture a partire da E6.5, l'HCS può essere sostituito da HBS appena raccolto. - Rimuovere metà del mezzo e aggiungere 250 μL di EUCM preriscaldato appena preparato dopo 24 ore di coltura, assicurando che gli embrioni siano sempre immersi nel terreno di coltura. Nel caso di colture a partire da E5.5, dopo due giorni di coltura (equivalente a E7.5), rimuovere 200 μL e aggiungere 250 μL di nuovo EUCM.
NOTA: Durante la coltura statica, gli embrioni potrebbero attaccarsi alla piastra (principalmente quando si usano piastre di plastica), il che comprometterà gravemente lo sviluppo dell'embrione. L'attaccamento dell'embrione alla piastra è più frequente il primo giorno di coltura di embrioni E5.5. Per evitare l'attaccamento, spingere con attenzione gli embrioni lontano dalla superficie della piastra usando una pinza fine e sterile. Verificare che solo il cono ectoplacentare rimanga attaccato alla superficie della piastra. - Trasferire gli embrioni nella coltura a rulli allo stadio iniziale di somite (4-7 somiti; dopo tre giorni di coltura per gli embrioni espiantati a E5,5 e due giorni per le colture iniziate a E6,5), seguendo le stesse indicazioni descritte in precedenza per gli embrioni allo stadio E8,5.
NOTA: Il trasferimento degli embrioni alla coltura a rulli in stadi somiti diversi da quelli sopra indicati comporta il fallimento di un ulteriore sviluppo. A differenza delle colture esogene E7.5, è possibile mantenere gli embrioni in un'atmosfera costante del 21% di ossigeno e del 5% di CO2, fornendo un'efficienza leggermente superiore dello sviluppo embrionale rispetto alle atmosfere con concentrazione dinamica di ossigeno.
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Representative Results
Le condizioni di coltura a rulli descritte per gli embrioni E7.5 (fase di gastrulazione tardiva) supportano una crescita embrionale costante e normale con un'efficienza media vicina al 75% dopo 4 giorni di coltura (Figura 2 e Tabella 1). L'efficienza dello sviluppo embrionale può variare in base a diversi background genetici di topo, ma è costantemente robusta (Figura 2C). L'integrazione con HBS invece di HCS produce un'efficienza di ~ 68% dopo 4 giorni di coltura ex utero , a seconda del background genetico dei topi (Figura 2D e Tabella 2). Gli embrioni sviluppati ex utero ricapitolano il corretto sviluppo fino a circa lo stadio 44-somite. Successivamente, gli embrioni presentano anomalie embrionali dovute all'assenza della placenta allantoica, con conseguente insufficiente ossigenazione e apporto di nutrienti dato l'aumento delle dimensioni corporee in questa fase.
Lo sviluppo di embrioni di E6,5 (striscia precoce) in piastre statiche è correttamente ricapitolato con un'efficienza del >90% fino allo stadio iniziale di somite E8.5, utilizzando EUCM sia con HCS che con HBS (Figura 3, Tabella 3 e Tabella 4) (vedere 8,13 per una descrizione dettagliata della stadiazione embrionale tra E5,5 ed E8,5). La coltura ex utero dalla gastrulazione all'organogenesi avanzata combinando colture su piastre statiche seguite dalla coltura a rulli in un'atmosfera di ossigeno costante al 21% fornisce un'efficienza stimata di corretto sviluppo del 55% e del 26% allo stadio 44-somite, utilizzando rispettivamente HCS e HBS (Figura 3A, Tabella 3 e Tabella 4). C'è un ritardo di 1-2 coppie di somiti in questi embrioni rispetto agli embrioni sviluppati in utero. Il più grande calo di efficienza si verifica alla transizione da E8.5 a E9.5 a causa del fallimento della rotazione assiale e della chiusura del tubo neurale.
Le colture a partire da embrioni pre-strutturanti E5.5 mostrano un'efficienza di sviluppo corretto fino allo stadio di somite precoce (E8.5) di circa il 46% e quasi il 17% degli embrioni completerà il corretto sviluppo dopo sei giorni di coltura dopo essere stato trasferito alla coltura a rulli (Figura 4 e Tabella 5). La coltura estesa in ex utero prolunga il ritardo dello sviluppo negli embrioni, con embrioni espiantati a E5,5 che mostrano un ritardo di 2-4 coppie di somiti rispetto agli embrioni in vivo . Tuttavia, la morfogenesi e lo sviluppo dei tessuti procedono correttamente fino a circa lo stadio 42-somite.
I difetti più comuni osservati negli embrioni per colture iniziate da E7.5, E6.5 ed E5.5 sono esemplificati nella Figura 5A-C. Al momento della dissezione, gli embrioni con danni anche minori all'epiblasto o alla regione extraembrionale, così come gli embrioni che trattengono la membrana di Reichert, dovrebbero essere scartati. Allo stesso modo, gli embrioni precoci non cresceranno correttamente (vedi Figura 5B per gli embrioni morti) o mostreranno gravi ritardi nello sviluppo (vedi Figura 5B per un embrione ritardato). L'attaccamento dell'epiblasto embrionale alla superficie della piastra influenzerà lo sviluppo a seconda della posizione e del grado di attaccamento. L'attaccamento di una parte dell'epiblasto o dell'intero embrione causerà il fallimento di un ulteriore sviluppo (vedere figura 5B per un embrione attaccato).
Le principali anomalie osservate nella percentuale di embrioni difettosi a E8,5 (stadio di somite precoce) sono lo sviluppo della regione posteriore al di fuori del sacco vitellino o difetti nella crescita delle pieghe neurali (Figura 5A,B). Nel caso di colture iniziate a E5.5, un difetto di sviluppo frequentemente osservato è la presenza di un piccolo epiblasto sottosviluppato (Figura 5C). Al tempo equivalente a E9.5, i difetti nella chiusura delle pieghe neurali, il fallimento della rotazione assiale o una carenza nella crescita cerebrale rappresentano le anomalie più comunemente osservate (Figura 5). I difetti dello sviluppo più frequentemente osservati a E10.5/E11 sono anomalie nella regione della testa, interruzione della normale circolazione sanguigna nel sacco vitellino e versamento pericardico (Figura 5). La rottura di un vaso sanguigno principale e il deflusso di sangue possono causare la successiva morte dell'embrione. In particolare, la corretta crescita dell'embrione stesso potrebbe essere raggiunta anche in assenza di evidente circolazione del sacco vitellino. Gli embrioni tenuti in coltura oltre lo stadio equivalente a E11 mostrano restringimento del corpo e morte dopo poche ore a causa della mancanza di un'adeguata ossigenazione dei tessuti.
Figura 1: Sistema di regolazione del gas e della pressione adattato a un incubatore di colture a rulli. (A) Vista dall'alto del modulo di regolazione del gas collegato all'incubatore di colture a rulli. N2 e CO2 entrano nel regolatore del gas per consentire un controllo preciso delle concentrazioni di ossigeno/CO2 e della pressione del gas. I gas sono diretti verso la scatola di miscelazione, in cui vengono miscelati da un soffiatore centrifugo e iniettati nell'incubatore da una pompa che genera pressione positiva. Il gas scorre attraverso l'ingresso in una bottiglia d'acqua e successivamente nelle bottiglie sigillate. (B) Configurazione interna del modulo elettronico per la regolazione del gas e della pressione. Il valore di tensione impostato sul trasmettitore di pressione regola la pressione generata dalla pompa all'interno della scatola di miscelazione del gas (5-6 V per raggiungere una pressione di 6-7 psi in questo specifico modello). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La piattaforma di coltura ex utero supporta la crescita di embrioni E7.5 fino all'organogenesi avanzata. (A) Diagramma raffigurante il protocollo di coltura embrionale ex utero E7.5. (B) Immagini rappresentative in campo luminoso di gruppi di embrioni in coltura che sviluppano ex utero nell'arco di 4 giorni, dalla gastrulazione tardiva (E7.5) allo stadio 44-somite (E11). È indicata la variazione tipica del numero di somiti valutata ogni 24 ore. Barre di scala = 500 μm. (C, D) Percentuale di embrioni normalmente sviluppati a 1-4 giorni di coltura a partire da E7,5 diviso per ceppi parentali di topo e integrazione sierica (C, siero di sangue del cordone ombelicale umano; D, siero di sangue umano adulto). Il pannello A è stato modificato da 13. Abbreviazioni: EUCM = mezzo di coltura embrionale ex utero ; HCS = siero di sangue del cordone ombelicale umano; HBS = siero di sangue umano adulto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Protocollo di coltura ex utero esteso per la coltivazione di embrioni di topo con gastrulazione precoce E6.5 fino all'organogenesi tardiva. (A) Illustrazione schematica del protocollo di coltura ex utero esteso che combina piastre statiche e sistemi di bottiglie rotanti. (B) Immagini in campo luminoso di embrioni coltivati ex utero per cinque giorni dallo stadio E6.5 allo stadio 44-somite. È indicata la variazione tipica del numero di somiti valutata ogni 24 ore. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Coltura continua in ex utero di embrioni di topo pregastruttulanti da E5.5 fino a stadi di organogenesi tardivi. (A) Rappresentazione schematica della coltura ex utero del protocollo per gli embrioni E5.5. (B) Immagini rappresentative in campo luminoso di embrioni coltivati ex utero per sei giorni da E5.5 fino allo stadio 42-somite. È indicata la variazione tipica del numero di somiti valutata ogni 24 ore. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Difetti rappresentativi dello sviluppo osservati in embrioni coltivati ex utero. (A-C) Immagini al microscopio a campo luminoso di embrioni di topo anormali cresciuti ex utero a partire da E7.5 (A), E6.5 (B) o E5.5 (C). Una descrizione generale del difetto è fornita su ogni immagine. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Efficienza del corretto sviluppo degli embrioni isolati a E7,5 giorni dopo il coito. Gli embrioni sono stati coltivati ex utero per 4 giorni in EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). [-] indica che le colture non sono continuate a causa di requisiti sperimentali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Efficienza del corretto sviluppo di embrioni isolati a E7.5, coltivati ex utero per 4 giorni, sostituendo il siero di sangue del cordone ombelicale umano con siero di sangue umano adulto appena isolato. [-] indica che le colture non sono continuate a causa di requisiti sperimentali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Efficienza del corretto sviluppo di embrioni (B6D2F1/ICR) isolati a E6.5 e coltivati ex utero per 5 giorni utilizzando EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). La coltura ex utero è stata effettuata in coltura statica per due giorni (21% di O2) seguita da tre giorni in bottiglie rotanti al 21% di O2. [-] indica che le colture non sono continuate a causa di requisiti sperimentali. Abbreviazione: NA = non acquisito. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Efficienza del corretto sviluppo di embrioni (B6D2F1/ICR) isolati a E6.5 e coltivati ex utero per 5 giorni utilizzando EUCM (sostituendo il siero del sangue del cordone ombelicale umano con siero di sangue umano adulto appena isolato). Gli embrioni sono stati sviluppati in coltura statica per due giorni (21% di O2) seguiti da tre giorni in flaconi rotanti al 21% di O2. [-] indica che le colture non sono continuate a causa di requisiti sperimentali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5: Efficienza del corretto sviluppo di embrioni (B6D2F1/ICR) isolati a E5.5 e coltivati ex utero per 6 giorni utilizzando EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). Gli embrioni sono stati sviluppati in coltura statica per tre giorni (21% di O2) seguiti da tre giorni in flaconi rotanti al 21% di O2. [-] indica che le colture non sono continuate a causa di requisiti sperimentali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Il protocollo di coltura qui presentato può sostenere uno sviluppo corretto e continuo dell'embrione di topo ex utero per un massimo di sei giorni, da E5.5 a E11. In precedenza, gli embrioni in queste fasi di sviluppo potevano svilupparsi normalmente in coltura solo per brevi periodi (fino a 48 h)15. L'accoppiamento del modulo di regolazione del gas all'incubatore di coltura a rulli per un controllo preciso della concentrazione di ossigeno e della pressione iperbarica del gas è fondamentale per la corretta coltura di embrioni di topo qui descritta. L'aumento della pressione del gas a 7 psi migliora la diffusione dell'ossigeno, consentendo lo sviluppo embrionale fino a E11 in un'atmosfera fino al 21% di O2/ 5% di CO2, in contrasto con le condizioni precedentemente impiegate del 95% di O216, che possono essere dannose per l'embrione a lungo termine. Inoltre, è noto che la concentrazione di ossigeno svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale, poiché l'embriogenesi post-impianto precoce avviene in condizioni ipossiche17. Di conseguenza, la coltura di successo di embrioni a gastrulazione tardiva richiede un'atmosfera iniziale di O2 del 5%, con un aumento dinamico della concentrazione di ossigeno man mano che l'embrione cresce. Sorprendentemente, la coltura di embrioni pre/gastrulanti precoci in coltura statica al 5% di O2 ha ridotto drasticamente l'efficienza del corretto sviluppo embrionale rispetto al 21% di O2 e non hanno potuto svilupparsi ulteriormente fino a E9.5. Quest'ultimo potrebbe essere spiegato dal tasso più lento di diffusione di nutrienti e ossigeno attraverso i tessuti embrionali nella coltura statica rispetto alla coltura in flaconi rotanti1,10.
Inoltre, l'elevato contenuto di siero di sangue di ratto e del cordone ombelicale umano fornisce risultati più coerenti per la crescita di embrioni postipiantati precoci rispetto ai media integrati con il solo siero di ratto13,18. È importante sottolineare che il siero utilizzato per la coltura degli embrioni deve essere preparato dal sangue appena estratto. Sebbene il siero di ratto di alta qualità per la coltura di embrioni interi sia disponibile in commercio, il siero umano dovrebbe essere isolato internamente. L'integrazione con siero di sangue del cordone ombelicale umano può essere sostituita da siero isolato dal sangue umano adulto, che è ampiamente accessibile e fornisce ancora una crescita embrionale coerente ed efficiente.
Lo sviluppo embrionale efficace ed efficiente ex utero dipende anche fortemente da un accurato isolamento embrionale. In primo luogo, la procedura di dissezione deve essere eseguita in un mezzo di dissezione riscaldato a 37 °C e gli embrioni sezionati devono essere trasferiti nei flaconi/piastre di coltura entro 30 minuti. In secondo luogo, l'isolamento preciso dell'embrione dalla decidua e la rimozione della membrana di Reichert senza danneggiare l'epiblasto sono fondamentali per ottenere un'elevata efficienza dello sviluppo embrionale. In terzo luogo, solo gli embrioni allo stadio adeguato dovrebbero essere selezionati per la coltura, poiché gli embrioni precoci / ritardati non cresceranno correttamente.
La manipolazione degli embrioni durante il trasferimento è un altro punto essenziale durante la coltura ex utero , principalmente dopo lo sviluppo del sacco vitellino embrionale. Gli embrioni devono essere trasferiti con attenzione perché il danno ai principali vasi sanguigni del sacco vitellino potrebbe influire sul corretto sviluppo. Generalmente, più lungo è il periodo di coltura embrionale, minore è l'efficienza del normale sviluppo embrionale, cioè gli embrioni espiantati a E7,5 si svilupperanno con maggiore efficienza rispetto a quelli espiantati a E6,5 o E5,5. Inoltre, la presenza di antibiotici nel mezzo è fondamentale per prevenire la contaminazione se non è disponibile un microscopio di dissezione allocato all'interno di una cappa biologica.
Non si può escludere che altre piattaforme, livelli di pressione o condizioni possano consentire risultati simili o migliorati ai risultati ottenuti con il presente protocollo. Un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni descritte in questo studio è necessaria per raggiungere un'efficienza dello sviluppo embrionale pari a quella osservata dallo sviluppo intrauterino. Inoltre, lo sviluppo futuro di un mezzo definito privo di siero potrebbe aiutare a definire i requisiti metabolici e chimici specifici durante lo sviluppo dell'embrione di mammifero e ridurre la variabilità del siero da lotto a lotto. La necessità di una miscelazione costante di nutrienti e gas dopo E8.5 utilizzando la coltura di bottiglie rotanti nelle impostazioni attuali limita le capacità di imaging a lungo termine durante le fasi di organogenesi. Lo sviluppo futuro di dispositivi di microfluidica che consentano la miscela di gas e nutrienti in colture statiche accoppiate a configurazioni di microscopia potrebbe aiutare a superare questa sfida.
Gli embrioni coltivati ex utero possono essere manipolati sperimentalmente e mantenuti in coltura fino a stadi avanzati di organogenesi al di fuori dell'utero. In precedenza abbiamo dimostrato la capacità di introdurre diverse perturbazioni nello sviluppo di embrioni, come la manipolazione genetica mediante elettroporazione o infezione lentivirale, l'imaging dal vivo, l'innesto cellulare e gli studi teratogeni13. In definitiva, questa piattaforma può aiutare a scoprire le specifiche del destino cellulare e i meccanismi di formazione degli organi nei mammiferi consentendo la sperimentazione in tempo reale in embrioni di topo viventi per un massimo di sei giorni di sviluppo precoce post-impianto.
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Disclosures
J.H.H è consulente di Biological Industries Ltd e ha presentato una domanda di brevetto che copre le condizioni di coltura a rulli e statiche qui descritte (depositate da J.H.H. e dal Weizmann Institute of Science). Altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da Pascal e Ilana Mantoux; Consiglio europeo della ricerca (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Consiglio di Ricerca Medica Assistente di Volo (FAMRI); Cattedra israelo cancer research Fund (ICRF), BSF, Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, the Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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