كروماتوغرافيا شبه مستهدفة فائقة الأداء مقترنة بتحليل الطيف الكتلي للمستقلبات الفينولية في بلازما كبار السن
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن المستقلبات الفينولية في البلازما باستخدام طريقة قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي شبه المستهدفة.
Abstract
أعطيت مجموعة من 23 شخصا من كبار السن وجبات وظيفية (مشروب وكعك) وضعت خصيصا للوقاية من ساركوبينيا (فقدان كتلة العضلات المرتبط بالعمر). تم أخذ عينات البلازما في بداية التدخل وبعد 30 يوما من استهلاك الوجبات الوظيفية. تم إجراء كروماتوغرافيا شبه مستهدفة فائقة الأداء مقترنة بتحليل الكتلة الترادفية (UPLC-MS/MS) لتحديد المركبات الفينولية ومستقلباتها. تم ترسيب بروتينات البلازما بالإيثانول وتم تركيز العينات وإعادة تعليقها في المرحلة المتنقلة (1: 1 acetonitrile: water) قبل الحقن في أداة UPLC-MS/MS. تم إجراء الفصل باستخدام عمود الطور العكسي C18 ، وتم تحديد المركبات باستخدام كتلتها التجريبية وتوزيعها النظيري ونمط الشظايا. وتمت مقارنة المركبات ذات الأهمية بمركبات بنوك البيانات والمكتبة الداخلية شبه المستهدفة. أظهرت النتائج الأولية أن المستقلبات الرئيسية التي تم تحديدها بعد التدخل كانت حمض الفينيلاسيتيك ، والجليسيتين ، وحمض 3-هيدروكسي فينيل فاليريك ، وغوميسين M2.
Introduction
ساركوبينيا هو اضطراب هيكلي تدريجي مرتبط بفقدان العضلات المتسارع لدى كبار السن. تزيد هذه الحالة من خطر السقوط وتؤدي إلى أنشطة محدودة للحياة اليومية. ساركوبينيا موجودة في حوالي 5٪ -10٪ من الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما وحوالي 50٪ من الأشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 80 عاما أو أكثر1. لم تتم الموافقة على أي أدوية محددة لعلاج ساركوبينيا ، لذلك من المهم الوقاية من خلال النشاط البدني واتباع نظام غذائي متوازن بشكل جيد1,2. أظهرت التدخلات الغذائية مع الأطعمة المصممة خصيصا والمخصبة ببروتين الألبان والأحماض الأمينية الأساسية نتائج إيجابية في الوقاية من ساركوبينيا2. في دراسات أخرى ، أدرج المؤلفون الفيتامينات ومضادات الأكسدة ، مثل فيتامين E والايسوفلافون ، في النظام الغذائي ، مما زاد من فوائد اكتساب العضلات على الخصر والوركين 3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) هي شجرة تنمو في المناطق الاستوائية المكسيكية. وقد استهلكته ثقافات المايا بسبب قيمته الغذائية العالية4. وهو مصدر جيد للبروتين والألياف والمعادن ومضادات الأكسدة الفينولية ، مثل حمض الكلوروجينيك 5. نظرا لأنه يمكن طحنه إلى مسحوق واستخدامه في منتجات الخبز أو استهلاكه في المشروبات ، فقد قيمت الدراسات الحديثة دمج دقيق بذور رامون (RSF) في الأطعمة المختلفة لتحسين قيمتها الغذائية. تم صياغة مشروب بنكهة الكابتشينو المكمل من قبل مراسلون بلا حدود ، والذي كان يحتوي على نسبة عالية من الألياف الغذائية وكان يحتوي على أكثر من 6 غرامات من البروتين لكل حصة ، وكان مقبولا للغاية من قبل المستهلكين. وبالتالي، اعتبر بديلا محتملا لتلبية المتطلبات الغذائية الخاصة6. وفي دراسة متابعة، استخدمت مراسلون بلا حدود أيضا لصياغة الكعك ومشروب جديد غني بالبروتين والألياف الغذائية والمغذيات الدقيقة ومضادات الأكسدة الفينولية. تم استخدام الكعك والمشروبات في تدخل غذائي للأفراد المسنين ، الذين تناولوا كلا المنتجين مرتين في اليوم لمدة 30 يوما. بعد هذه الفترة ، تحسنت الحالة الغذائية والساركوبينية للمشاركين ، وزاد المحتوى الفينولي الكلي للبلازما7. ومع ذلك ، تم تحديد المركبات الفينولية الكلية في البلازما بطريقة الطيفية ، لذلك لم يكن من الممكن تحديد المركبات الفينولية الفعلية التي تم امتصاصها ؛ علاوة على ذلك ، هذه الطريقة ليست محددة تماما للمركبات الفينولية ، لذلك قد يحدث بعض المبالغة في التقدير8.
يعد تحديد المركبات الفينولية التي يتم امتصاصها بعد استهلاك الأطعمة الغنية بمضادات الأكسدة هذه مهمة صعبة ولكنها ضرورية لإثبات النشاط البيولوجي لهذه المواد الكيميائية النباتية. التوافر البيولوجي لمعظم المركبات الفينولية منخفض. يمكن العثور على أقل من 5٪ منها دون تحول هيكلي في البلازما. تخضع المركبات الفينولية للعديد من التحولات الحيوية ، مثل المثيلة أو السلفونات أو الجلوكورونايد ، والتي يتم تنفيذها بواسطة الخلايا المعوية وخلايا الكبد9. كما يتم تحويل المركبات الفينولية بيولوجيا بواسطة الميكروبات إلى هدم بكتيري قد يمارس آثاره المفيدة في الجسم بعد امتصاصه في البلازما10. على سبيل المثال ، حمض الفينيلاسيتيك هو نتاج التحول البكتيري للفلافونويد والبروانثوسيانيدينات قليلة القلة ، والتي يمكن أن تمنع ما يصل إلى 40 ٪ من التصاق البكتيريا (الإشريكية القولونية) في المسالك البولية بعد استهلاك التوت البري 11.
إن التنوع الهيكلي للمركبات الفينولية التي تحدث بشكل طبيعي ، بالإضافة إلى تنوع مستقلباتها وانخفاض توافرها البيولوجي ، يجعل تحديدها في البلازما أكثر تحديا. وربما يكون التنميط الأيضي، باستخدام منصات التحليل الطيفي مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والتحليل الطيفي الكتلي الترادفي (MS/MS)، أفضل نهج لتحقيق هذا الهدف؛ ولسوء الحظ، لا يمكن الوصول إلى المعدات بسهولة، ولا يزال تطوير بروتوكولات التحليل محدودا12. أبلغت العديد من الدراسات عن MS / MS إلى جانب نظام فصل (مثل الكروماتوغرافيا السائلة) كاستراتيجية للحد من تعقيد أطياف الكتلة في الدراسات الأيضية. أدى الإدخال الأخير لطرق فصل الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) إلى تقليل وقت التحليل وزيادة الدقة والحساسية مقارنة بالبروتوكولات السائلة التقليدية عالية الأداء، لذلك سرعان ما تم قبول أنظمة UPLC-MS/MS على نطاق واسع من قبل مجتمع الأيض التحليلي13. وبهذه الطريقة ، حققت بعض الدراسات في مستقلبات الفينول واكتشفت مشتقات الجلوكورونيدات من حمض الكافيين والكيرسيتين وحمض الفيروليك ، وكذلك المشتقات الكبريتية من حمض المحاقن والفانيليك في بلازما الأفراد بعد تناول التوت البري14. كانت البروتوكولات السابقة تهدف إلى العثور على المركبات الفينولية والمستقلبات الفينولية في السوائل الحيوية مثل البلازما. وقد استندت هذه البروتوكولات إلى تحديد الهوية والقياس الكمي بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) مقترنة بكاشف الأشعة فوق البنفسجية15. ومع ذلك، تتطلب هذه البروتوكولات استخدام معايير أصيلة لتقييم التحديد المطلق والقياس الكمي الدقيق. وقد حددت مجموعة واسعة من الدراسات المستقلبات الأكثر شيوعا في السوائل الحيوية (الأشكال الكبريتية والجلوكورونيدات والميثيلية) بواسطة UPLC-MS و UPLC-MS/MS؛ ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن جزء كبير من المستقلبات البكتيرية بسبب عدم وجود قواعد بيانات تحتوي على معلوماتها الكاملة16. تحديد الأيض معقد بسبب التكلفة والتوافر التجاري لمعايير الأيض. لذلك ، قد تكون أفضل استراتيجية هي تحليل مستقلب MS / MS غير المستهدف أو شبه المستهدف ، والذي يعتمد على استخدام معلومات المعالم الجزيئية (m / z ، الكتلة الدقيقة أحادية النظائر ، توزيع النظائر ، ونمط التجزئة) لتحديد الهوية الكيميائية ومقارنتها بقواعد البيانات المتاحة مجانا عبر الإنترنت التي تحتوي على مستقلبات البوليفينول المحددة في الموائع الحيوية بعد استهلاك polypolyphenol-richts12 . أهم قواعد البيانات المستخدمة في دراسات UPLC-MS/MS لتحديد المركبات الفينولية ومستقلباتها هي قاعدة بيانات الأيض البشري (HMDB) ومكتبة LipidBlast ومكتبة METLIN وقواعد البيانات التكميلية الأخرى ، مثل PubChem و ChemSpider و Phenol Explorer17.
في هذه الدراسة، تم تطوير طريقة UPLC-MS/MS شبه المستهدفة لتحليل عينات البلازما لمجموعة كبار السن المشاركين في دراسة استهلاك الكعك والمشروبات المحتوية على مراسلون بلا حدود7. تم جمع البيانات من قواعد بيانات مجانية مختلفة على الإنترنت لمستقلبات البلازما ودمجها في قاعدة بيانات متخصصة. يمكن الوصول إلى قاعدة البيانات هذه تلقائيا بواسطة برنامج المعدات لتحديد مستقلبات البوليفينول في عينات البلازما الخمس قبل وبعد التدخل الغذائي لمدة 30 يوما. يتم ذلك لتحديد المركبات الفينولية الرئيسية ، أو مستقلباتها ، التي يتم امتصاصها من الأطعمة الوظيفية المصممة خصيصا للوقاية من ساركوبينيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تحديد وقياس المواد الكيميائية النباتية النشطة بيولوجيا التي يتم امتصاصها بعد استهلاك طعام أو مكمل غذائي أمرا بالغ الأهمية لإظهار وفهم الفوائد الصحية لهذه المركبات والأطعمة التي تحتوي عليها. في هذا العمل ، تم تطوير طريقة UPLC-MS / MS ، التي تهدف فقط إلى تحديد المركبات الفينولية الرئيسية وم…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشعر المؤلفون بالامتنان للدعم المالي المقدم من CONACYT ، المكسيك (CB- 2016-01-286449) ، و UACJ-PIVA (المشروعان 313-17-16 و 335-18-13). يود OAMB أن يشكر CONACYT على منحة الدكتوراه الخاصة به. يتم الاعتراف بالدعم الفني من مكتب إنتاج الوسائط المتعددة من UACJ بامتنان.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Riferimenti
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
