अर्ध-लक्षित अल्ट्रा-उच्च-प्रदर्शन क्रोमैटोग्राफी बुजुर्ग वयस्कों के प्लाज्मा में फेनोलिक मेटाबोलाइट्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए युग्मित
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक अर्ध-लक्षित क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि का उपयोग करके प्लाज्मा में फेनोलिक मेटाबोलाइट्स का पता लगाना है।
Abstract
23 बुजुर्ग व्यक्तियों के एक समूह को कार्यात्मक भोजन (एक पेय और एक मफिन) विशेष रूप से सरकोपेनिया (मांसपेशियों के द्रव्यमान की उम्र से संबंधित हानि) की रोकथाम के लिए तैयार किया गया था। प्लाज्मा के नमूने हस्तक्षेप की शुरुआत में और कार्यात्मक भोजन का उपभोग करने के 30 दिनों के बाद लिए गए थे। फेनोलिक यौगिकों और उनके चयापचयों की पहचान करने के लिए अग्रानुक्रम द्रव्यमान (यूपीएलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण के साथ युग्मित एक अर्ध-लक्षित अल्ट्रा-उच्च-प्रदर्शन क्रोमैटोग्राफी किया गया था। प्लाज्मा प्रोटीन इथेनॉल के साथ अवक्षेपित किए गए थे और नमूनों को यूपीएलसी-एमएस / एमएस उपकरण में इंजेक्शन से पहले मोबाइल चरण (1: 1 एसिटोनिट्राइल: पानी) में केंद्रित और पुन: निलंबित कर दिया गया था। पृथक्करण को एक C18 रिवर्स-फेज कॉलम के साथ किया गया था, और यौगिकों को उनके प्रयोगात्मक द्रव्यमान, आइसोटोपिक वितरण और टुकड़ा पैटर्न का उपयोग करके पहचाना गया था। ब्याज के यौगिकों की तुलना डेटा बैंकों और आंतरिक अर्ध-लक्षित पुस्तकालय के उन लोगों से की गई थी। प्रारंभिक परिणामों से पता चला है कि हस्तक्षेप के बाद पहचाने जाने वाले प्रमुख मेटाबोलाइट्स फेनिलएसिटिक एसिड, ग्लाइसिटिन, 3-हाइड्रॉक्सीफेनाइलवेलेरिक एसिड और गोमिसिन एम 2 थे।
Introduction
सरकोपेनिया एक प्रगतिशील कंकाल विकार है जो बुजुर्ग आबादी में मांसपेशियों के त्वरित नुकसान से संबंधित है। यह स्थिति गिरने के जोखिम को बढ़ाती है और दैनिक जीवन की सीमित गतिविधियों की ओर ले जाती है। सरकोपेनिया 65 वर्ष से अधिक आयु के लगभग 5% -10% व्यक्तियों और 80 वर्ष या उससे अधिक आयु के लगभग 50% व्यक्तियों में मौजूद है। सरकोपेनिया के उपचार के लिए कोई विशिष्ट दवाओं को अनुमोदित नहीं किया गया है, इसलिए शारीरिक गतिविधि और एक अच्छी तरह से संतुलित आहार के साथ रोकथाम महत्वपूर्ण है1,2। डेयरी प्रोटीन और आवश्यक अमीनो एसिड से समृद्ध विशेष रूप से तैयार किए गए खाद्य पदार्थों के साथ पोषण संबंधी हस्तक्षेपों ने सरकोपेनिया 2 को रोकने में सकारात्मक परिणाम दिखाए हैं। अन्य अध्ययनों में, लेखकों ने विटामिन और एंटीऑक्सिडेंट, जैसे विटामिन ई और आइसोफ्लेवोन्स को आहार में शामिल किया है, जिससे कमर और कूल्हों पर मांसपेशियों के लाभ के लिए लाभ बढ़ जाता है।
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) एक पेड़ है जो मैक्सिकन उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में बढ़ता है; यह अपने उच्च पोषण मूल्य के कारण माया संस्कृतियों द्वारा उपभोग किया गया है4. यह प्रोटीन, फाइबर, खनिज, और फेनोलिक एंटीऑक्सिडेंट का एक अच्छा स्रोत है, जैसे कि क्लोरोजेनिक एसिड 5। चूंकि इसे पाउडर में जमीन पर रखा जा सकता है और बेकिंग उत्पादों में उपयोग किया जा सकता है या पेय पदार्थों में खाया जा सकता है, हाल के अध्ययनों ने अपने पोषण मूल्य में सुधार करने के लिए विभिन्न खाद्य पदार्थों में रेमन बीज आटा (आरएसएफ) को शामिल करने का मूल्यांकन किया है। एक आरएसएफ-पूरक कैपुचिनो-स्वाद वाले पेय को तैयार किया गया था, जो आहार फाइबर में उच्च था और प्रति सेवारत 6 ग्राम से अधिक प्रोटीन था, और उपभोक्ताओं द्वारा अत्यधिक स्वीकार किया गया था; इस प्रकार, इसे विशेष आहार आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एक संभावित विकल्प माना जाता था6। एक अनुवर्ती अध्ययन में, आरएसएफ का उपयोग एक मफिन और प्रोटीन, आहार फाइबर, माइक्रोन्यूट्रिएंट्स और फेनोलिक एंटीऑक्सिडेंट में समृद्ध एक नए पेय को तैयार करने के लिए भी किया गया था। मफिन और पेय का उपयोग बुजुर्ग व्यक्तियों के लिए आहार हस्तक्षेप में किया गया था, जिन्होंने 30 दिनों के लिए प्रति दिन दो बार दोनों उत्पादों का सेवन किया था। इस अवधि के बाद, प्रतिभागियों की पोषण और सार्कोपेनिक स्थिति में सुधार हुआ, और प्लाज्मा की कुल फेनोलिक सामग्री में वृद्धि हुई। हालांकि, प्लाज्मा में कुल फेनोलिक यौगिकों का निर्धारण एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधि द्वारा किया गया था, इसलिए अवशोषित किए गए वास्तविक फेनोलिक यौगिकों की पहचान संभव नहीं थी; इसके अलावा, यह विधि फेनोलिक यौगिकों के लिए पूरी तरह से विशिष्ट नहीं है, इसलिए कुछ अतिरेक हो सकता है8।
इन एंटीऑक्सिडेंट में समृद्ध खाद्य पदार्थों की खपत के बाद अवशोषित होने वाले फेनोलिक यौगिकों की पहचान और परिमाणीकरण एक कठिन कार्य है, लेकिन इन फाइटोकेमिकल्स की जैविक गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक है। अधिकांश फेनोलिक यौगिकों की जैव उपलब्धता कम है; उनमें से 5% से कम प्लाज्मा में संरचनात्मक परिवर्तन के बिना पाया जा सकता है। फेनोलिक यौगिक कई बायोट्रांसफॉर्मेशन से गुजरते हैं, जैसे कि मिथाइलेशन, सल्फोनेशन, या ग्लूकोरोनिडेशन, जो एंटरोसाइट्स और हेपेटोसाइट्स 9 द्वारा किए जाते हैं। फेनोलिक यौगिकों को माइक्रोबायोटा द्वारा बैक्टीरियल कैटाबोलाइट्स में भी बायोट्रांसफॉर्म किया जाता है जो प्लाज्मा 10 में अवशोषित होने के बाद शरीर में अपने लाभकारी प्रभाव डाल सकते हैं। उदाहरण के लिए, फेनिलएसिटिक एसिड फ्लेवोनोइड्स और ओलिगोमेरिक प्रोएंथोसायनिडिन के जीवाणु परिवर्तन का एक उत्पाद है, जो क्रैनबेरी खपत के बाद मूत्र पथ में बैक्टीरिया (एस्चेरिचिया कोलाई) आसंजन के 40% तक को रोक सकता है।
स्वाभाविक रूप से होने वाले फेनोलिक यौगिकों की संरचनात्मक विविधता, उनके चयापचयों की विविधता और उनकी कम जैव उपलब्धता में जोड़ा गया है, प्लाज्मा में उनकी पहचान को और भी अधिक चुनौतीपूर्ण बनाता है। मेटाबोलोमिक प्रोफाइलिंग, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और अग्रानुक्रम द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी (एमएस / एमएस) जैसे स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण प्लेटफार्मों का उपयोग करके, शायद इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा दृष्टिकोण है; दुर्भाग्य से, उपकरण आसानी से सुलभ नहीं है, और विश्लेषण प्रोटोकॉल का विकास अभी भी सीमित है12। कई अध्ययनों ने मेटाबोलोमिक अध्ययनों में द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की जटिलता को कम करने के लिए एक रणनीति के रूप में एक पृथक्करण प्रणाली (जैसे तरल क्रोमैटोग्राफी) के साथ एमएस / एमएस की सूचना दी है। अल्ट्रा-उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (यूपीएलसी) पृथक्करण विधियों की हालिया शुरुआत ने विश्लेषण के समय को कम कर दिया है और पारंपरिक उच्च-प्रदर्शन तरल प्रोटोकॉल की तुलना में संकल्प और संवेदनशीलता में वृद्धि की है, इसलिए यूपीएलसी-एमएस / एमएस सिस्टम को विश्लेषणात्मक मेटाबोलोमिक्स समुदाय 13 द्वारा तेजी से व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है। इस तरह, कुछ अध्ययनों ने फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की जांच की है और कैफेइक एसिड, क्वेरसेटिन और फेरुलिक एसिड से ग्लूकोरोनिडेट डेरिवेटिव का पता लगाया है, साथ ही क्रैनबेरी इनटेक 14 के बाद व्यक्तियों के प्लाज्मा में सिरिंगिक और वैनिलिक एसिड से सल्फोनेटेड डेरिवेटिव भी पाए गए हैं। पिछले प्रोटोकॉल ने प्लाज्मा जैसे बायोफ्लुइड्स में फेनोलिक यौगिकों और फेनोलिक मेटाबोलाइट्स को खोजने का इरादा किया है। ये प्रोटोकॉल उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा यूवी-विज़ डिटेक्टर 15 के साथ मिलकर पहचान और परिमाणीकरण पर आधारित थे। फिर भी, इस तरह के प्रोटोकॉल को पूर्ण पहचान और सटीक परिमाणीकरण का आकलन करने के लिए प्रामाणिक मानकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला ने यूपीएलसी-एमएस और यूपीएलसी-एमएस / एमएस द्वारा बायोफ्लुइड्स (सल्फोनेटेड, ग्लूकोरोनिडेट और मेथिलेटेड रूपों) में सबसे आम चयापचयों की पहचान की है; हालांकि, बैक्टीरियल मेटाबोलाइट्स का एक बड़ा हिस्सा डेटाबेस की कमी के कारण रिपोर्ट नहीं किया गया है जिसमें उनकी पूरी जानकारी होती है16। मेटाबोलाइट पहचान मेटाबोलाइट मानकों की लागत और वाणिज्यिक उपलब्धता से जटिल है। इसलिए, सबसे अच्छी रणनीति अनलक्षित या अर्ध-लक्षित एमएस / एमएस मेटाबोलाइट विश्लेषण हो सकती है, जो रासायनिक पहचान को निर्धारित करने के लिए आणविक विशेषता जानकारी (एम / जेड, मोनोआइसोटोपिक सटीक द्रव्यमान, आइसोटोपिक वितरण और विखंडन पैटर्न) के उपयोग पर निर्भर करती है और इसकी तुलना स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन डेटाबेस के साथ करती है जिसमें पॉलीपोलीफेनोल-रिचट्स 12 की खपत के बाद बायोफ्लुइड्स में पहचाने जाने वाले पॉलीफेनोल मेटाबोलाइट्स होते हैं। . फेनोलिक यौगिकों और उनके मेटाबोलाइट्स की पहचान के लिए यूपीएलसी-एमएस / एमएस अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले सबसे महत्वपूर्ण डेटाबेस मानव मेटाबोलोम डेटाबेस (एचएमडीबी), लिपिडब्लास्ट लाइब्रेरी, एमईटीलिन लाइब्रेरी और अन्य पूरक डेटाबेस हैं, जैसे कि PubChem, ChemSpider, और फिनोल एक्सप्लोरर 17।
वर्तमान अध्ययन में, आरएसएफ युक्त मफिन और पेय खपत अध्ययन में शामिल बुजुर्ग व्यक्तियों के समूह के प्लाज्मा नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक अर्ध-लक्षित यूपीएलसी-एमएस / एमएस विधि विकसित की गई थी। प्लाज्मा मेटाबोलाइट्स के विभिन्न मुफ्त ऑनलाइन डेटाबेस से डेटा एकत्र किया गया था और एक विशेष डेटाबेस में एकीकृत किया गया था। इस डेटाबेस को उपकरण सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से एक्सेस किया जा सकता है ताकि 30-दिवसीय पोषण हस्तक्षेप से पहले और बाद में पांच प्लाज्मा नमूनों में पॉलीफेनोलिक मेटाबोलाइट्स की पहचान की जा सके। यह मुख्य फेनोलिक यौगिकों, या उनके चयापचयों की पहचान करने के लिए किया जाता है, जो सरकोपेनिया की रोकथाम के लिए डिज़ाइन किए गए विशेष रूप से तैयार किए गए कार्यात्मक खाद्य पदार्थों से अवशोषित होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
खाद्य या खाद्य पूरक की खपत के बाद अवशोषित होने वाले बायोएक्टिव फाइटोकेमिकल्स की पहचान और परिमाणीकरण इन यौगिकों और उनसे युक्त खाद्य पदार्थों के स्वास्थ्य लाभों को प्रदर्शित करने और समझने के लिए महत्व…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखककॉनासाइट, मेक्सिको (सीबी- 2016-01-286449), और UACJ-PIVA (परियोजनाएं 313-17-16 और 335-18-13) से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं। OAMB अपनी पीएचडी छात्रवृत्ति के लिए CONACYT को धन्यवाद देना चाहता है। UACJ से मल्टीमीडिया उत्पादन कार्यालय से तकनीकी सहायता कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार की जाती है।
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Riferimenti
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
