Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos
Summary
O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma usando um método de espectrometria de massa cromatografia-masscamo semi-direcionada.
Abstract
Um grupo de 23 idosos recebeu refeições funcionais (uma bebida e um muffin) especialmente formuladas para a prevenção da sarcopenia (perda de massa muscular relacionada à idade). Amostras de plasma foram colhidas no início da intervenção e após 30 dias de consumo das refeições funcionais. Foi realizada uma cromatografia ultra-alta performance semi-direcionada juntamente com a análise de massa tandem (UPLC-MS/MS) para identificar compostos fenólicos e seus metabólitos. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com etanol e as amostras foram concentradas e resuspendidas na fase móvel (acetonitrilo 1:1: água) antes da injeção no instrumento UPLC-MS/MS. A separação foi realizada com uma coluna de fase inversa C18 , e os compostos foram identificados utilizando sua massa experimental, distribuição isotópica e padrão de fragmento. Os compostos de juros foram comparados aos dos bancos de dados e da biblioteca interna sem-direcionada. Os resultados preliminares mostraram que os principais metabólitos identificados após a intervenção foram ácido fenídrico, glicacitina, ácido 3-hidroxifenilvalerico e gomisina M2.
Introduction
Sarcopenia é um transtorno esquelético progressivo relacionado à perda acelerada de músculos na população idosa. Essa condição aumenta o risco de quedas e leva a atividades limitadas da vida diária. A sarcopenia está presente em cerca de 5%-10% das pessoas com mais de 65 anos e cerca de 50% das pessoas com 80 anos ou mais de idade1. Nenhum medicamentos específicos foi aprovado para o tratamento da sarcopenia, por isso a prevenção com atividade física e uma dieta bem equilibrada é importante1,2. Intervenções nutricionais com alimentos especialmente formulados enriquecidos com proteína leiteira e aminoácidos essenciais têm mostrado resultados positivos na prevenção da sarcopenia2. Em outros estudos, os autores incluíram vitaminas e antioxidantes, como vitamina E e isoflavonas, na dieta, aumentando os benefícios para o ganho muscular na cintura e nos quadris3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) é uma árvore que cresce nas regiões tropicais mexicanas; tem sido consumida por culturas maias devido ao seu alto valor nutricional4. É uma boa fonte de proteínas, fibras, minerais e antioxidantes fenólicos, como o ácido clorogênico5. Como pode ser moído em pó e usado em produtos de panificação ou consumidos em bebidas, estudos recentes têm avaliado a incorporação da farinha de sementes de Ramón (RSF) em diferentes alimentos para melhorar seu valor nutricional. Uma bebida com sabor de cappuccino suplementada pela RSF foi formulada, que era rica em fibras alimentares e tinha mais de 6 g de proteína por porção, e era altamente aceita pelos consumidores; assim, considerou-se uma alternativa potencial para atender aos requisitos alimentares especiais6. Em um estudo de acompanhamento, a RSF também foi usada para formular um muffin e uma nova bebida rica em proteínas, fibras alimentares, micronutrientes e antioxidantes fenólicos. O muffin e a bebida foram utilizados em uma intervenção dietética para idosos, que consumiram ambos os produtos duas vezes por dia durante 30 dias. Após esse período, o estado nutricional e sarcopenico dos participantes melhorou, e o teor fenólico total do plasma aumentou7. No entanto, a determinação dos compostos fenólicos totais no plasma foi realizada por um método espectrofotométrico, de modo que a identificação dos compostos fenólicos reais que foram absorvidos não foi possível; além disso, este método não é completamente específico para compostos fenólicos, de modo que alguma superestimação pode ocorrer8.
A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é uma tarefa difícil, mas é necessária para demonstrar a atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos compostos fenólicos é baixa; menos de 5% deles podem ser encontrados sem transformação estrutural no plasma. Os compostos fenólicos passam por várias biotransformações, como metilação, sulfonação ou glucuronidação, que são realizadas por enterócitos e hepatócitos9. Compostos fenólicos também são biotransformados pela microbiota em catabólitos bacterianos que podem exercer seus efeitos benéficos no corpo após serem absorvidos pelo plasma10. Por exemplo, o ácido fenilacetic é um produto da transformação bacteriana de flavonoides e proanthociaanidinas oligomerícos, que podem inibir até 40% da adesão de bactérias (Escherichia coli) no trato urinário após o consumo de cranberry11.
A diversidade estrutural de compostos fenólicos de ocorrência natural, somada à diversidade de seus metabólitos e sua baixa biodisponibilidade, torna sua identificação no plasma ainda mais desafiadora. O perfil metabolômico, utilizando plataformas de análise espectroscópica, como ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia de massa tandem (MS/MS), é provavelmente a melhor abordagem para alcançar esse objetivo; infelizmente, o equipamento não é facilmente acessível, e o desenvolvimento de protocolos de análise ainda é limitado12. Vários estudos têm relatado a ESM/MS juntamente com um sistema de separação (como a cromatografia líquida) como estratégia para reduzir a complexidade dos espectros de massa em estudos metabolômicos. A recente introdução de métodos de separação de cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC) reduziu o tempo de análise e aumentou a resolução e sensibilidade em comparação com os protocolos líquidos convencionais de alto desempenho, de modo que os sistemas UPLC-MS/MS têm sido rapidamente amplamente aceitos pela comunidade de metabolômicas analítica13. Dessa forma, alguns estudos investigaram metabólitos fenólicos e detectaram derivados colacuronidados de ácido cafeína, quercetina e ácido ferúlico, bem como derivados sulfoados de ácido seringa e vanlícita no plasma de indivíduos após a ingestão de cranberry14. Protocolos anteriores têm a intenção de encontrar compostos fenólicos e metabólitos fenólicos em biofluidos como plasma. Estes protocolos foram baseados na identificação e quantificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplado a um detector UV-vis15. No entanto, tais protocolos exigem o uso de padrões autênticos para avaliar a identificação absoluta e quantificação precisa. Uma ampla gama de estudos identificou os metabólitos mais comuns em biofluidos (formas sulfotadas, glucuronidas e metiladas) por UPLC-MS e UPLC-MS/MS; no entanto, grande parte dos metabólitos bacterianos não foi relatada devido à falta de bancos de dados que contenham suas informações completas16. A identificação metabólica é complicada pelo custo e disponibilidade comercial das normas metabólitos. Portanto, a melhor estratégia pode ser a análise metabólica MS/MS sem alvo ou semi-direcionada, que se baseia no uso de informações de características moleculares (m/z, massa exata monoisotópica, distribuição isotópica e padrão de fragmentação) para determinar a identidade química e compara-a com bancos de dados on-line livremente disponíveis que contêm metabólitos polifenóis identificados em biofluóides após o consumo de polipólitos-richts12 . As bases de dados mais importantes utilizadas em estudos UPLC-MS/MS para identificação de compostos fenólicos e seus metabólitos são o Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library e outros bancos de dados complementares, como PubChem, ChemSpider e Phenol Explorer17.
No presente estudo, foi desenvolvido um método uplc-MS/MS semi-direcionado para analisar as amostras de plasma do grupo de idosos envolvidos no estudo de consumo de muffin e bebidas contendo RSF7. Dados de diferentes bancos de dados online gratuitos de metabólitos de plasma foram coletados e integrados em um banco de dados especializado. Este banco de dados pode ser acessado automaticamente pelo software do equipamento para identificar os metabólitos polifenólicos nas cinco amostras de plasma antes e depois da intervenção nutricional de 30 dias. Isso é feito para identificar os principais compostos fenólicos, ou seus metabólitos, que são absorvidos dos alimentos funcionais especialmente formulados projetados para a prevenção da sarcopenia.
Protocol
Representative Results
Discussion
A identificação e quantificação dos fitoquímicos bioativos que são absorvidos após o consumo de um suplemento alimentar ou alimentar são cruciais para demonstrar e compreender os benefícios para a saúde desses compostos e dos alimentos que os contêm. No presente trabalho, foi desenvolvido o método UPLC-MS/MS, voltado apenas para a identificação dos principais compostos fenólicos e seus metabólitos que aumentaram na concentração no plasma após uma intervenção nutricional de 30 dias com dois produtos a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio financeiro da CONACYT, México (CB- 2016-01-286449) e UACJ-PIVA (Projetos 313-17-16 e 335-18-13). A OAMB agradece à CONACYT por sua bolsa de doutorado. O suporte técnico do escritório de Produção Multimídia da UACJ é reconhecido com gratidão.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Riferimenti
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