Yaşlı Yetişkinlerin Plazmasındaki Fenolik Metabolitlerin Kütle Spektrometri Analizine Bağlanan Yarı Hedefli Ultra Yüksek Performanslı Kromatografi
Summary
Bu protokolün amacı, yarı hedefli kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemi kullanarak plazmadaki fenolik metabolitleri tespit etmektir.
Abstract
23 yaşlı kişiden oluşan bir gruba, sarkopeninin (yaşa bağlı kas kütlesi kaybı) önlenmesi için özel olarak formüle edilmiş fonksiyonel yemekler (bir içecek ve bir kek) verildi. Plazma örnekleri, müdahalenin başlangıcında ve fonksiyonel öğünlerin tüketilmesinden 30 gün sonra alındı. Fenolik bileşikleri ve metabolitlerini tanımlamak için tandem kütle (UPLC-MS / MS) analizi ile birleştirilmiş yarı hedefli ultra yüksek performanslı kromatografi gerçekleştirildi. Plazma proteinleri etanol ile çökeltildi ve numuneler UPLC-MS / MS cihazına enjeksiyondan önce mobil fazda (1: 1 asetonitril: su) konsantre edildi ve yeniden askıya alındı. Ayırma bir C18 ters faz sütunu ile gerçekleştirildi ve bileşikler deneysel kütleleri, izotopik dağılımları ve fragman desenleri kullanılarak tanımlandı. İlgilenilen bileşikler, veri bankalarının ve dahili yarı hedefli kütüphaneninkilerle karşılaştırıldı. Ön sonuçlar, müdahaleden sonra tanımlanan başlıca metabolitlerin fenilasetik asit, glisitin, 3-hidroksifenilvalerik asit ve gomisin M2 olduğunu göstermiştir.
Introduction
Sarkopeni yaşlı popülasyonda hızlandırılmış kas kaybına bağlı ilerleyici bir iskelet hastalığıdır. Bu durum düşme riskini arttırır ve günlük yaşam aktivitelerinin sınırlı olmasına neden olur. Sarkopeni, 65 yaşın üzerindeki kişilerin yaklaşık% 5-10’unda ve 80 yaş ve üstü kişilerin yaklaşık% 50’sinde bulunur1. Sarkopeni tedavisi için spesifik bir ilaç onaylanmamıştır, bu nedenle fiziksel aktivite ve dengeli bir diyetle korunma önemlidir1,2. Süt proteini ve esansiyel amino asitlerle zenginleştirilmiş özel olarak formüle edilmiş gıdalarla yapılan beslenme müdahaleleri, sarkopeninin önlenmesinde olumlu sonuçlar göstermiştir2. Diğer çalışmalarda, yazarlar diyete E vitamini ve izoflavonlar gibi vitamin ve antioksidanları dahil ederek, bel ve kalçalardaki kas kazanımının faydalarını arttırmıştır3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón), Meksika tropikal bölgelerinde yetişen bir ağaçtır; yüksek besin değeri nedeniyle Maya kültürleri tarafından tüketilmiştir4. İyi bir protein, lif, mineral ve klorojenik asit gibi fenolik antioksidanlar kaynağıdır5. Toz haline getirilebildiği ve pişirme ürünlerinde kullanılabildiği veya içeceklerde tüketilebildiği için, son çalışmalar Ramón tohumu ununun (RSF) besin değerlerini artırmak için farklı gıdalara dahil edilmesini değerlendirmiştir. RSF takviyeli kapuçino aromalı bir içecek formüle edildi, diyet lifi bakımından yüksekti ve porsiyon başına 6 g’dan fazla protein içeriyordu ve tüketiciler tarafından oldukça kabul edildi; bu nedenle, özel diyet gereksinimlerini karşılamak için potansiyel bir alternatif olarak kabul edildi6. Bir takip çalışmasında, RSF ayrıca bir kek ve protein, diyet lifi, mikro besinler ve fenolik antioksidanlar bakımından zengin yeni bir içecek formüle etmek için kullanıldı. Muffin ve içecek, her iki ürünü de 30 gün boyunca günde iki kez tüketen yaşlı bireyler için bir diyet müdahalesinde kullanıldı. Bu süreden sonra, katılımcıların beslenme ve sarkopenik durumları iyileşti ve plazmanın toplam fenolik içeriği arttı7. Bununla birlikte, plazmadaki toplam fenolik bileşiklerin belirlenmesi spektrofotometrik bir yöntemle gerçekleştirilmiştir, bu nedenle emilen gerçek fenolik bileşiklerin tanımlanması mümkün olmamıştır; Dahası, bu yöntem fenolik bileşikler için tamamen spesifik değildir, bu nedenle bazı abartılı tahminler meydana gelebilir8.
Bu antioksidanlar bakımından zengin gıdaların tüketiminden sonra emilen fenolik bileşiklerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi zor bir iştir, ancak bu fitokimyasalların biyolojik aktivitesini göstermek için gereklidir. Çoğu fenolik bileşiğin biyoyararlanımı düşüktür; Bunların %5’inden azı plazmada yapısal dönüşüm olmadan bulunabilir. Fenolik bileşikler, enterositler ve hepatositler tarafından gerçekleştirilen metilasyon, sülfonasyon veya glukuronidasyon gibi çeşitli biyotransformasyonlara uğrar9. Fenolik bileşikler ayrıca mikrobiyota tarafından plazmaya emildikten sonra vücutta yararlı etkilerini gösterebilecek bakteriyel katabolitlere biyotransforme edilir10. Örneğin, fenilasetik asit, flavonoidlerin ve oligomerik proantosiyanidinlerin bakteriyel dönüşümünün bir ürünüdür ve kızılcık tüketiminden sonra idrar yollarındaki bakterilerin (Escherichia coli) yapışmasının% 40’ına kadarını inhibe edebilir11.
Doğal olarak oluşan fenolik bileşiklerin yapısal çeşitliliği, metabolitlerinin çeşitliliğine ve düşük biyoyararlanımlarına eklendiğinde, plazmadaki tanımlamalarını daha da zorlaştırmaktadır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve tandem kütle spektroskopisi (MS / MS) gibi spektroskopik analiz platformlarını kullanan metabolomik profilleme, muhtemelen bu hedefe ulaşmak için en iyi yaklaşımdır; ne yazık ki, ekipmana kolayca erişilemez ve analiz protokollerinin geliştirilmesi hala sınırlıdır12. Birçok çalışma, metabolomik çalışmalarda kütle spektrumlarının karmaşıklığını azaltmak için bir strateji olarak MS / MS’in bir ayırma sistemi (sıvı kromatografisi gibi) ile birleştiğini bildirmiştir. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) ayırma yöntemlerinin yakın zamanda piyasaya sürülmesi, analiz süresini kısaltmış ve geleneksel yüksek performanslı sıvı protokollerine kıyasla çözünürlüğü ve hassasiyeti artırmıştır, bu nedenle UPLC-MS / MS sistemleri analitik metabolomik topluluğu tarafından hızla kabul görmüştür13. Bu şekilde, bazı çalışmalar fenolik metabolitleri araştırmış ve kızılcık alımından sonra bireylerin plazmasında kafeinik asit, quercetin ve ferulik asitten glukuronid türevlerinin yanı sıra şırıngaik ve vanilik asitten sülfonlu türevleri tespit etmiştir14. Önceki protokoller, plazma gibi biyoakışkanlarda fenolik bileşikleri ve fenolik metabolitleri bulmayı amaçlamıştır. Bu protokoller, bir UV-vis dedektörüne bağlanmış yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile tanımlama ve nicelleştirmeye dayanıyordu15. Bununla birlikte, bu tür protokoller, mutlak tanımlamayı ve doğru nicelemeyi değerlendirmek için otantik standartların kullanılmasını gerektirir. Çok çeşitli çalışmalar, biyoakışkanlarda (sülfonlanmış, glukuronidlenmiş ve metillenmiş formlar) UPLC-MS ve UPLC-MS / MS tarafından en yaygın metabolitleri tanımlamıştır; Bununla birlikte, bakteriyel metabolitlerin büyük bir kısmı, tam bilgilerini içeren veritabanlarının bulunmaması nedeniyle bildirilmemiştir16. Metabolit tanımlama, metabolit standartlarının maliyeti ve ticari kullanılabilirliği nedeniyle karmaşıktır. Bu nedenle, en iyi strateji, kimyasal kimliği belirlemek için moleküler özellik bilgilerinin (m / z, monoizotopik tam kütle, izotopik dağılım ve parçalanma paterni) kullanılmasına dayanan ve polipolifenol-richts tüketiminden sonra biyoakışkanlarda tanımlanan polifenol metabolitlerini içeren serbestçe kullanılabilen çevrimiçi veritabanlarıyla karşılaştıran hedefsiz veya yarı hedefli MS / MS metabolit analizi olabilir12 . Fenolik bileşiklerin ve metabolitlerinin tanımlanması için UPLC-MS / MS çalışmalarında kullanılan en önemli veritabanları İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB), LipidBlast Kütüphanesi, METLIN Kütüphanesi ve PubChem, ChemSpider ve Phenol Explorer17 gibi diğer tamamlayıcı veritabanlarıdır.
Bu çalışmada, RSF içeren çörek ve içecek tüketimi çalışmasına katılan yaşlı insan grubunun plazma örneklerini analiz etmek için yarı hedefli bir UPLC-MS/MS yöntemi geliştirilmiştir7. Plazma metabolitlerinin farklı ücretsiz çevrimiçi veritabanlarından elde edilen veriler toplandı ve özel bir veritabanına entegre edildi. Bu veritabanına, 30 günlük beslenme müdahalesinden önce ve sonra beş plazma örneğindeki polifenolik metabolitleri tanımlamak için ekipman yazılımı tarafından otomatik olarak erişilebilir. Bu, sarkopeninin önlenmesi için tasarlanmış özel olarak formüle edilmiş fonksiyonel gıdalardan emilen ana fenolik bileşikleri veya metabolitlerini tanımlamak için yapılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir gıda veya gıda takviyesinin tüketiminden sonra emilen biyoaktif fitokimyasalların tanımlanması ve miktarının belirlenmesi, bu bileşiklerin ve bunları içeren gıdaların sağlık yararlarını göstermek ve anlamak için çok önemlidir. Bu çalışmada, sadece yaşlılar için özel olarak formüle edilmiş iki gıda ürünü ile 30 günlük bir beslenme müdahalesinden sonra plazmada konsantrasyonu artan ana fenolik bileşiklerin ve metabolitlerinin tanımlanmasına yönelik UPLC-MS / MS yöntemi gelişti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, CONACYT, Meksika (CB- 2016-01-286449) ve UACJ-PIVA’nın (Projeler 313-17-16 ve 335-18-13) finansal desteği için minnettardır. OAMB, doktora bursu için CONACYT’e teşekkür eder. UACJ’nin Multimedya Üretim ofisinden gelen teknik destek minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Riferimenti
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
