वयस्क ज़ेबराफिश में एक यांत्रिक मस्तिष्क की चोट मॉडल को उनकी उच्च पुनर्योजी क्षमता को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की जांच करने के लिए वर्णित किया गया है। फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए विधि छोटी मछलियों की कई प्रजातियों के ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट बनाने के लिए बताती है।
जबकि ज़ेबराफिश में अपने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को पुनर्जीवित करने की बेहतर क्षमता होती है, मेडाका में कम सीएनएस पुनर्योजी क्षमता होती है। ज़ेब्राफिश और मेडाका के वयस्क ऑप्टिक टेक्टम में एक मस्तिष्क की चोट मॉडल विकसित किया गया था और इन मछली प्रजातियों में इस ऊतक की उच्च पुनर्योजी क्षमता को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए तुलनात्मक हिस्टोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण किए गए थे। यहां तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) के प्रसार और भेदभाव के लिए सुई और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का उपयोग करके वयस्क ऑप्टिक टेक्टम के लिए एक चाकू घाव की चोट मॉडल प्रस्तुत किया गया है। ऑप्टिक टेक्टम के मध्य क्षेत्र में मैन्युअल रूप से एक सुई डाली गई थी, और फिर मछली को इंट्राकार्डियल रूप से संक्रमित किया गया था, और उनके दिमाग को विच्छेदित किया गया था। इन ऊतकों को तब क्रायोसेक्शन किया गया और उचित एनएससी प्रसार और भेदभाव मार्करों के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया। यह टेक्टम चोट मॉडल ज़ेबराफिश और मेडाका दोनों में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है, जिससे चोट के बाद एनएससी प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति मिलती है। यह विधि छोटे टेलोस्ट के लिए उपलब्ध है, जिसमें ज़ेबराफ़िश, मेडाका और अफ्रीकी किलीफ़िश शामिल हैं, और हमें उनकी पुनर्योजी क्षमता की तुलना करने और अद्वितीय आणविक तंत्र की जांच करने में सक्षम बनाता है।
ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) में अन्य स्तनधारियों 1,2,3 की तुलना में अपने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को पुनर्जीवित करने की क्षमता में वृद्धि हुई है। हाल ही में, इस बढ़ी हुई पुनर्योजी क्षमता को अंतर्निहित आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करके ऊतक पुनर्जनन का तुलनात्मक विश्लेषण 4,5,6 किया गया है। ज़ेबराफिश और टेट्रापोड्स में मस्तिष्क संरचनाएंकाफी अलग हैं 7,8,9। इसका मतलब यह है कि समान मस्तिष्क संरचनाओं और जैविक विशेषताओं के साथ छोटी मछलियों का उपयोग करके कई मस्तिष्क की चोट मॉडल विकसित किए गए हैं ताकि इस बढ़ी हुई पुनर्योजी क्षमता में योगदान देने वाले अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच की सुविधा मिल सके।
इसके अलावा, मेडाका (ओरिज़ियास लैटिप्स) जेब्राफिश की तुलना में हृदय और न्यूरोनल पुनर्जनन10,11,12,13 के लिए कम क्षमता वाला एक लोकप्रिय प्रयोगशाला जानवर है। ज़ेबराफिश और मेडाका में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) 14,15,16,17 के लिए समान मस्तिष्क संरचनाएं और niches हैं। ज़ेबराफ़िश और मेडाका में, ऑप्टिक टेक्टम में दो प्रकार के एनएससी शामिल हैं, न्यूरोएपिथेलियल जैसी स्टेम सेल और रेडियल ग्लियल सेल (आरजीसी) 15,18। वयस्क ज़ेबराफिश के ऑप्टिक टेक्टम के लिए एक चाकू घाव की चोट पहले विकसित की गई थी, और इस मॉडल का उपयोग इन जानवरों में मस्तिष्क पुनर्जनन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की जांच करने के लिए किया गया था 19,20,21,22,23। इस युवा वयस्क ज़ेबराफिश घाव की चोट मॉडल ने आरजीसी 19,24,25 से पुनर्योजी न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित किया। ऑप्टिक टेक्टम में यह चाकू घाव की चोट एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है 13,19,20,21,22,23,24,25। जब वयस्क मेडाका पर एक ही चोट मॉडल लागू किया गया था, तो चोट13 के बाद आरजीसी प्रसार और भेदभाव के तुलनात्मक विश्लेषण के माध्यम से मेडका ऑप्टिक टेक्टम में आरजीसी की कम न्यूरोजेनिक क्षमता का पता चला था।
ऑप्टिक टेक्टम में स्टैब घाव की चोट के मॉडल भी मम्मिचोग मॉडल26 में विकसित किए गए हैं, लेकिन टेलेसेफेलिक चोट27 की तुलना में टेक्टम चोट का विवरण अच्छी तरह से प्रलेखित नहीं किया गया है। जेब्राफिश और मेडाका का उपयोग करके ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट अंतर पुनर्योजी क्षमता वाली प्रजातियों के बीच अंतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं और जीन अभिव्यक्ति की जांच की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि इंजेक्शन सुई का उपयोग करके ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट कैसे की जाए। इस विधि को जेब्राफिश और मेडाका जैसी छोटी मछलियों पर लागू किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और क्रायोसेक्शन का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और सेलुलर प्रसार और भेदभाव विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं को यहां समझाया गया है।
यहां विधियों का एक सेट वर्णित किया गया है जिसका उपयोग मस्तिष्क की चोट के बाद आरजीसी प्रसार और भेदभाव के मूल्यांकन की सुविधा के लिए सुई का उपयोग करके ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोटों को प्रेरित करन…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 18K14824 और 21K15195 और AIST, जापान के आंतरिक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
Cryostat | Leica | CM1960 | |
Danio rerio WT strains RW | |||
Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
Oryzias latipes WT strains Cab | |||
PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
Triton X-100 | Wako | 04605-250 |