Mikrodisseksjon og dissosiasjon av Murine Oviduct: Individuell segmentidentifikasjon og enkeltcelleisolasjon

Summary

En metode for mikrodisseksjon av musens ovidukt som tillater innsamling av de enkelte segmentene samtidig som RNA-integriteten opprettholdes. I tillegg er ikke-enzymatisk oviductal celle dissosiasjonsprosedyre beskrevet. Metodene er egnet for påfølgende gen- og proteinanalyse av de funksjonelt forskjellige oviduktsegmentene og dissosierte oviduktceller.

Abstract

Musemodellsystemer er uovertruffen for analyse av sykdomsprosesser på grunn av deres genetiske manipulabilitet og lave kostnader for eksperimentelle behandlinger. Men på grunn av deres lille kroppsstørrelse har noen strukturer, som ovidukten med en diameter på 200-400 μm, vist seg å være relativt vanskelig å studere bortsett fra ved immunhiistokjemi. Nylig har immunhiistokjemiske studier avdekket mer komplekse forskjeller i oviduktsegmenter enn tidligere anerkjent; Dermed er ovidukten delt inn i fire funksjonelle segmenter med forskjellige forhold mellom syv forskjellige epitelcelletyper. De forskjellige embryologiske opprinnelsene og forholdene til epitelcelletypene gjør sannsynligvis de fire funksjonelle regionene differensialt utsatt for sykdom. For eksempel oppstår forløperlesjoner til serøse intraepitheliale karsinomer fra infundibulum i musemodeller og fra den tilsvarende fimbrial-regionen i det menneskelige egglederne. Protokollen som er beskrevet her beskriver en metode for mikrodisseksjon for å dele opp ovidukten på en slik måte at den gir tilstrekkelig mengde og renhet av RNA som er nødvendig for nedstrømsanalyser som omvendt transkripsjon-kvantitativ PCR (RT-qPCR) og RNA-sekvensering (RNAseq). Også beskrevet er en for det meste ikke-enzymatisk vev dissosiasjonsmetode egnet for strømning cytometri eller enkeltcellet RNAseq analyse av fullt differensierte oviduktceller. Metodene som beskrives vil lette videre forskning ved hjelp av murin ovidukten innen reproduksjon, fruktbarhet, kreft og immunologi.

Introduction

Murin ovidukten er lik i funksjon og morfologi til det menneskelige fallopianrøret1. Begge består av et pseudostratifisert ciliated epitel, bestående av to historisk beskrevne epitelceller: ciliated celler og sekretoriske ^celler1,2. Ovidukten har tre klassisk anerkjente segmenter: infundibulum, ampulla og isthmus. I en nylig studie, Harwalkar et al. ³ undersøkte oviduktmorfologi og genuttrykk som førte til utvidelse av kategorisering av bosatte epitelceller til syv forskjellige populasjoner. I tillegg etablerte de ampullary-isthmus-krysset som et tydelig segment av ovidukten3. Metoden som er beskrevet her, som fokuserer på infundibulum, ampulla og isthmus, kan lett utvides til å omfatte det ampullære-iskemiske krysset ^også2,3. Den infundibulære regionen inneholder ostium, eller åpning av ovidukten, og inkluderer fimbrialområdet så vel som den proksimale stengelen. Beveger seg mot livmoren, neste er ampulla, og deretter isthmus. Ciliated celler er mest fremtredende i den distale enden av regionen, proksimal til eggstokken, eller infundibulum, mens sekretoriske celler er mest fremtredende i den proksimale enden eller isthmus ^segment1. I motsetning til det menneskelige egglederen er murin ovidukten en spolet struktur støttet av mesosalpinxen, en forlengelse av det brede ligamentperitoneum1,4. I tillegg er mus ovidukten innkapslet i en bursalsekk som øker sannsynligheten for oocyttoverføring til ovidukten4. Ampulla er identifisert som plasseringen av befruktning, hvorfra utviklende embryoer passerer inn i isthmus før de går inn i ^livmoren5. Tubal segmenter er 200-400 μm i diameter og lengre ampullære og isthmus regioner er ca 0,5-1,0 cm i ^lengde4. Ovidukten distendene under østrogensyklusen og ampulla og infundibulum er mer distensible enn ^isthmus1.

Over spredning av celler, spesielt sekretoriske celler, karakteriserer forløperlesjoner til serøse svulster som finnes i bekkenhulen6. Disse forløper serøse intraepitheliale lesjonene oppstår i oviduktepitelet utelukkende i fimbrialområdet; Det er ukjent hvorfor lesjonsdannelse er begrenset til denne regionen der normalt den dominerende celletypen er ciliated, ikke sekretorisk2,7,8. Regionaliteten når det gjelder normal fysiologisk funksjon, samt økt interesse for oviduktal opprinnelse av eggstokkkreft9,10,11,12,13, understreker viktigheten av separat evaluering av oviduktsegmentene.

Metoden som er beskrevet her beskriver innsamlingen av separate oviduktsegmenter for påfølgende nedstrømsanalyser av segmentspesifikke genuttrykk og funksjon av dissosierte celler. Tradisjonelt behandles mange vev for hele RNA-ekstraksjon etter enten fenol: kloroformmetode eller en komplett ekstraksjonsmetode på kolonnen; Vi fant imidlertid at RNA-kvaliteten ble opprettholdt samtidig som den produserte tilstrekkelig avkastning med den beskrevne kombinasjonsmetoden. Ved hjelp av denne metoden kan svært små funksjonelle segmenter av ovidukten behandles for nedstrømsanalyser i stedet for å undersøke ovidukten som helhet, noe som kan maskere resultater som er representative for de forskjellige ^segmentene14.

Dissosierte murinlegende celler har sjelden blitt undersøkt av strømningscytometri, mest sannsynlig på grunn av det begrensende celleutbyttet fra dette vevet. En tilnærming for å overvinne dette problemet har vært å dissosiere celler, vokse dem i kultur, og deretter stimulere re-differensiering in vitro for å oppnå passende celletall for nedstrøms celleanalyse15,16,17,18. En begrensning i denne tilnærmingen er tiden ex vivo og endret mikromiljø i kulturen, som begge sannsynligvis endrer genuttrykk. Det er også en antagelse at morfologisk re-differensiering har samme transkripsjonelle og proteomiske signatur som var tilstede i det intakte dyret. Den nåværende dissosiasjonsmetoden ble designet for å oppnå det høyeste antallet epitelceller i en heterogen oviduktcellepopulasjon samtidig som man opprettholder encellet differensiering. Videre begrenser den for det meste ikke-enzymatiske tilnærmingen sannsynligvis tapet av celleoverflateproteiner.

Protocol

All dyrehåndtering og prosedyrer ble godkjent av University of California, Riverside institusjonelle dyrepleie- og brukskomité og var i samsvar med retningslinjer fra American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture og National Institutes of Health. Den beskrevne metoden benyttet C57BL/6 voksne, kvinnelige mus. Alle dyr ble avlivet ved halshugging før vevshøsting. MERK: En oversikt over protokollen, som bruker et blått fargestoff for å hjelpe til m…

Representative Results

Den beskrevne dissosiasjonsprotokollen gir 100 000-120 000 celler per mus ved sammenslåing av begge oviduktene. Metoden er mild nok til å la multi-ciliated cellekantlinjer være intakte, noe som gir et skille mellom multi-ciliated celler og sekretoriske celler, og verifisere at fordøyelsesmetoden er mild nok til å forhindre avdifferensiering. Representative immunfluorescensbilder i figur 5 viser små celleklumper etter trinn 4.2.1, festet i 3 min i 4% paraformaldehyd (PFA)/ DPBS, vasket …

Discussion

De tre segmentene av ovidukten er histologisk, morfologisk og funksjonelt distinkte1,2,3. Epitelet varierer sterkt fra den ene enden av ovidukten til den andre. Ciliated celler dominerer i den fimbrial / infundibulære enden, mens sekretoriske celler dominerer i den istemiske ^regionen1. Selv om denne samlede gradienten har blitt anerkjent i noen tid, har nyere arbeid avdekket flere forskjeller blant ovidu…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines