JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Een contrast van drie inentingstechnieken die worden gebruikt om het ras van onbekend Fusarium oxysporum f.sp. te bepalen. niveum Isolaten

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

Het beheren van Fusarium-verwelking van watermeloen vereist kennis van de aanwezige pathogene rassen. Hier beschrijven we de worteldip, aangetaste kernel seeding en gemodificeerde tray-dip inentingsmethoden om hun werkzaamheid aan te tonen bij rastypering van de pathogene schimmel Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium verwelking van watermeloen (Citrullus lanatus), veroorzaakt door Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), is opnieuw opgedoken als een belangrijke productiebeperking in het zuidoosten van de VS, vooral in Florida. De inzet van geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategieën, zoals rasspecifieke resistente cultivars, vereist informatie over de diversiteit en bevolkingsdichtheid van de ziekteverwekker op de velden van telers. Ondanks enige vooruitgang in de ontwikkeling van moleculaire diagnostische hulpmiddelen om pathogene isolaten te identificeren, vereist rasbepaling vaak bioassay-benaderingen.

Rastypering werd uitgevoerd door worteldipinenting, besmette kernelzaaimethode en de gemodificeerde tray-dip-methode met elk van de vier watermeloenverschillen (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolaten krijgen een rasaanduiding toegewezen door berekening van de ziekte-incidentie vijf weken na inenting. Als minder dan 33% van de planten voor een bepaalde cultivar symptomatisch was, werden ze gecategoriseerd als resistent. De cultivars met een incidentie van meer dan 33% werden als vatbaar beschouwd. Dit artikel beschrijft drie verschillende methoden van inenting om ras, worteldip, besmette kernel en gemodificeerde tray-dip inenting vast te stellen, waarvan de toepassingen variëren afhankelijk van het experimentele ontwerp.

Introduction

De bodemschimmels die deel uitmaken van het Fusarium oxysporum species complex (FOSC) zijn impactvolle hemibiotrofe plantpathogenen die ernstige ziekten en opbrengstverlies kunnen veroorzaken in een breed scala van gewassen1. Fusarium verwelking van watermeloen, veroorzaakt door F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), is de afgelopen decennia over de hele wereld toegenomen in omvang, incidentie en ernst 2,3. Bij zaailingen lijken de symptomen van Fusarium-verwelking vaak op demping. Bij oudere planten wordt het gebladerte grijs, chlorotisch en necrotisch. Uiteindelijk gaat het verwelken van de planten over tot volledige instorting van de plant en de dood4. Direct opbrengstverlies treedt op als gevolg van de symptomen en plantensterfte, terwijl indirect opbrengstverlies kan optreden als gevolg van schade door de zon veroorzaakt door de eliminatie van het bladluifel5. Seksuele voortplanting en bijbehorende voortplantingsstructuren zijn nooit waargenomen in F. oxysporum. De ziekteverwekker produceert echter twee soorten aseksuele sporen, micro- en macroconidia, evenals grotere, langdurige overlevingsstructuren genaamd chlamydospores, die vele jaren in de bodem kunnen overleven6.

De FOSC wordt ingedeeld in formae speciales op basis van waargenomen gastheerbereiken, meestal beperkt tot één of enkele gastheersoorten1. Hoewel recent onderzoek heeft aangetoond dat dit soortencomplex een samenstelling van 15 verschillende soorten kan zijn, zijn de specifieke soorten die watermeloen infecteren momenteel onbekend7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) is de naam voor de groepen stammen die uitsluitend Citrullus lanatus of de gedomesticeerde watermeloeninfecteren 8,9. F. oxysporumstammen binnen de meeste pathogene formae speciales vertonen bepaalde niveaus van diversiteit met betrekking tot hun genetische componenten en virulentie ten opzichte van een gastheersoort. De ene stam kan bijvoorbeeld alle cultivars van een gastheer infecteren, terwijl een andere alleen de meer gevoelige cultivars kan infecteren. Om een dergelijke variatie te verklaren, worden deze groepen informeel ingedeeld in rassen op basis van evolutionaire relaties of gemeenschappelijke fenotypische kenmerken. Binnen Fon zijn vier rassen (0, 1, 2 en 3) gekarakteriseerd op basis van hun pathogeniciteit tegen een reeks geselecteerde watermeloencultivars, waarbij de ontdekking van ras 3 onlangs10 plaatsvond.

Ondanks deze schijnbare diversiteit zijn de morfologieën van sporen of koppeltekens niet te onderscheiden tussen de rassen van Fon-rassen, wat betekent dat moleculaire of fenotypische assays nodig zijn om het unieke ras van een isolaat te identificeren11. Moleculair onderzoek heeft enkele genetische verschillen geïdentificeerd. De rol van Uitgescheiden in Xylem (SIX) effectoren is bijvoorbeeld al jaren bestudeerd in F. oxysporum, en sommige van deze effectoren bevinden zich op de chromosomen die worden uitgewisseld tijdens horizontale genoverdracht12. SIX6 is bijvoorbeeld te vinden in Fon races 0 en 1, maar niet in race 213. ZES effectoren zijn betrokken bij de pathogeniciteit van F. oxysporum f. sp. lycopersici en F. oxysporum f. sp. cubense, die Fusarium-verwelking veroorzaken op tomaat en banaan, respectievelijk 14,15,16,17. De analyse van SIX-effectorprofielen tussen stammen van F. oxysporum f. sp. spiniciae, de Fusarium-verwelkingspathogeen op spinazie, heeft classificatie mogelijk gemaakt die de genetische en fenotypische diversiteit nauwkeurig weerspiegelt18. De verschillen tussen virulentiemechanismen van Fon-rassen zijn momenteel echter niet volledig begrepen en moleculaire assays die bij hun gebruik zijn ontwikkeld, hebben inconsistente en onnauwkeurige resultaten laten zien19. Daarom zijn fenotypische resultaten van infectietests momenteel de beste manier om isolaten te classificeren.

F. oxysporum infecteert aanvankelijk gastheren via de wortels voordat het zich een weg baant naar het xyleem20. Dit maakt directe inenting van de wortels van een bepaalde gastheercultivar een effectieve manier om rastypering uit te voeren en is de basis van de worteldip- en traydipinentingsmethoden21. Wanneer een gastheer niet wordt geïnfecteerd, bevindt F. oxysporum zich in de grond en kan het jarenlang inactief blijven. Het kweken van vatbare watermeloencultivars in grond uit een interessegebied is een manier om te testen op de aanwezigheid van Fon. Het uitbreiden van deze methode met cultivars van verschillende bekende niveaus van resistentie in grond die opzettelijk is aangetast met Fon is ook een goede manier om rastypering uit te voeren (tabel 1) en is de basis van de besmette kernelzaaimethode. De aangepaste tray-dip methode is een variant op de oorspronkelijke tray-dip methode die een high-throughput race-typering mogelijk maakt waarbij veel planten en veldisolaten snel kunnen worden onderzocht22. Belangrijke factoren van een snelle en succesvolle rastyperingsbioassay zijn onder meer het gebruik van cultivars die verschillen in resistentie tegen de verschillende pathogene rassen hebben gedocumenteerd, ervoor zorgen dat het entmateriaal zowel biologisch actief als overvloedig is tijdens infectie, het handhaven van een omgeving die zowel bevorderlijk is voor de ziekteverwekker als de gastheer, en het gebruik van een consistent beoordelingssysteem voor ernst of incidentie van ziekte. Dit artikel beschrijft de root-dip23,24, infested kernel seeding25,26 en gemodificeerde tray-dip22 methoden voor fenotypische race-typering op basis van de hierboven beschreven principes.

Protocol

1. Ras bepalen met root-dip methode (RDM) Voorbereiding van de experimentele omgeving Omdat symptoomexpressie sterk afhankelijk is van omgevingsomstandigheden, moet u planten in een gecontroleerd gebied houden. Controleer de relatieve vochtigheid, temperatuur, fotoperiode en lichtintensiteit (figuur 1). Stel de temperatuur in op 26-28 °C, de relatieve vochtigheid op 50-75% en stel een fotoperiode van 16 uur in om voldoende plantengroei en gezondhei…

Representative Results

Deze experimenten helpen bij het definiëren van de relatieve weerstand van vaak gekweekte cultivars (tabel 1). Deze informatie kan vervolgens worden gebruikt om managementaanbevelingen te sturen op basis van lokale Fon-populaties. Met andere woorden, als ras 0 of 1 bekend is in een commercieel veld, dan kan de boer geneigd zijn om een “resistente” variëteit zoals Calhoun Gray, Sunsugar of gelijkwaardig te kweken. De resultaten van de bioassays met behulp van alle methoden laten zien dat wanneer de zaai…

Discussion

Er zijn drie methoden voor rastypering gepresenteerd. Elk van deze methoden is het meest geschikt voor specifieke vragen en experimentele omstandigheden. De infestatiemethode voor aangetaste pitten (bodeminfestatie) is misschien eenvoudiger en eenvoudiger, waardoor het vooral nuttig is voor de beoordeling van pathogeniciteit30. Het gebruik van deze methode voor eenvoudige race-typering is zeer effectief. Het toepassen van de methode om de resistentie van een specifieke cultivar te bepalen kan echt…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Dr. Ali en het Plant Molecular Diagnostic Laboratory bedanken, evenals Dr. Pingsheng Ji aan de Universiteit van Georgia, wiens leiderschap en ondersteuning hebben bijgedragen aan het opzetten van ons Fon-programma.

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  6. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  7. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  8. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  9. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  10. Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
  11. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  12. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  13. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  14. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  15. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  16. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  17. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  18. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  19. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  20. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  21. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  22. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  23. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  24. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  25. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  26. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  27. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  28. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  29. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  30. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
  31. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  32. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  33. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  34. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  35. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  36. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  37. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  38. Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  39. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  40. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  41. Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  42. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  43. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  44. O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  45. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  46. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Keywords: Fusarium WiltRace-typingBioassayInoculationWatermelonPathogenDisease ManagementPlant HealthV8 Juice MediumPotato Dextrose AgarConidiaSpore QuantificationBleachPlantletsRoot Rinsing
check_url/it/63181?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image